烟草品种“大叶密合”青枯病抗性遗传分析

张振臣，吕永华，马柱文，谢锐鸿，李集勤，袁清华，李淑玲，吕锦津，陈俊标

1 广东省农业科学院作物研究所，广州市天河区五山金颖西二街18号 510640;

2 广东省农作物遗传改良重点实验室，广州 510640;

3 广东省烟草专卖局（公司），广州 510610

烟草品种“大叶密合”青枯病抗性遗传分析

张振臣1,2，吕永华3，马柱文1,2，谢锐鸿1,2，李集勤1,2，袁清华1,2，李淑玲1,2，吕锦津1,2，陈俊标1,2

1 广东省农业科学院作物研究所，广州市天河区五山金颖西二街18号 510640;

2 广东省农作物遗传改良重点实验室，广州 510640;

3 广东省烟草专卖局（公司），广州 510610

选用大叶密合和5个对青枯病具有不同抗性水平的烟草品种，按完全双列杂交设计，采用Griffing方法I及Hayman方法进行遗传分析，并应用植物数量性状主基因＋多基因混合遗传模型对大叶密合（抗病品种）×长脖黄（感病品种）组合P1、P2、F1和F2等4个世代群体的青枯病抗性进行了联合分析。结果表明：参试品种的青枯病抗性为细胞核遗传；大叶密合×长脖黄组合的青枯病抗性遗传符合2对加性-显性-上位性主基因＋加性-显性多基因遗传模型（E-1），主基因的加性和显性效应值分别为0.5013、-0.3023和1.6439、0.8401,多基因的加性和显性效应值分别为-1.3989和-1.7798，主基因遗传率63.95%，利用大叶密合进行抗病育种，适宜在分离晚世代进行选择并加大后代筛选群体。大叶密合与NC95的抗性遗传存在差异，后者的抗性表现为加性遗传。

烟草；品种；青枯病；抗性；遗传

由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的烟草青枯病是我国烟草生产上重要的病害之一，该病害的药剂防治效果目前尚不十分理想，控制烟草青枯病最根本、最有效的措施是选育抗病品种。至今，已报道发现的烟草青枯病抗性资源主要有4类：1、普通烟草品种TI448A ，具有高水平抗性[1]，是抗病育种中应用最广泛的品种，由此育成的DB101及其衍生的Coker139、NC95和Coker319是抗青枯病育种的主体亲本[2]，多年来其抗性为隐性多基因遗传的结论被广泛接受[1-3]。CORESTA 青枯病研究协作组1995年－2000年在世界烟叶主产区中国、巴西、美国、南非、津巴布韦等地对NC95、Hicks 、F1 (NC 95×Hicks)等品种（材料）进行了多年多点抗性鉴定，结果表明：抗性来源于TI448A的品种NC95表现为多基因的加性遗传[4]。2、香料烟品种Xanthi，由部分显性基因Rxa控制的抗性，具有低抗或中抗水平[5-6]。3、日本地方烟草品种Kokubu，由部分显性基因Rps控制的抗性，在病害压力较低时，表现为低抗至中抗[7]。4、日本地方烟草品种Enshu AC，由部分显性基因Rps和多基因控制的抗性，具有高水平抗性[5]。大叶密合是广东地方晒烟农家品种，遗传系谱不明，笔者经多年抗性鉴定发现其青枯病抗性较强[8]。为更好的为育种所利用，按完全双列杂交设计，采用Griffing方法І及Hayman方法[9]进行遗传分析；构建P1、P2、F1和F2等4个世代群体，采用章元明等（2000）植物数量性状混合遗传模型主基因+多基因多世代联合分析方法[10-11]，分析大叶密合的抗性遗传规律，为烟草抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

感病品种长脖黄和不同抗性品种NC95、大叶密合、岩烟97、封开-10、谷嘴，6个亲本的完全双列杂交共36个组合（包括亲本），大叶密合×长脖黄F2。其中，大叶密合、封开-10、谷嘴是广东地方晒烟种质资源。

1.2 方法

2011年完成6个亲本的完全双列杂交，共36个组合（包括亲本）。2011年12月播种F1种子，2012年3月14日移栽于广州市白云区试验田，随机区组设计，3次重复，每小区种植20株，行株距1.1米×0.4米。5月4日采用切根灌菌液的方法，接种中等致病力青枯病菌（属生理小种1、生化变种Ⅲ，由华南农业大学植物细菌研究室提供），每株灌150ml的细菌悬浮液（1×107细菌/ml）。以小区病情指数作方差分析；一般配合力按照Griffing方法I[9]，应用DPS软件分析；回归分析按Hayman双列杂交方法[9]，应用EXCEL软件统计分析。

2012年通过单株套袋自交获得大叶密合×长脖黄F2代种子。2013年3月初将大叶密合（P1）、长脖黄（P2）及其F1和F2种植于上年度接种青枯病田块（2012年下半年在该田块种植烟草，感病品种发病严重；根据发病情况，做好接种准备）。亲本、F1设4个重复，随机区组设计，每重复种植15株。F2种植300株。采用数量性状主基因+多基因混合遗传分析windows版本软件包SEA[12]对其组合P1、P2、F1和F2等4个世代单株的发病级别进行分析，其中P1、P2、F1的病级为重复平均数。假定数量性状分别受1对主基因、2对主基因、多基因、1对主+多基因和2对主+多基因控制，分别建立A～E 5类共24个遗传模型，根据极大似然函数、AIC值和适合性检验【均匀性检验（），Smirnov检验（nW2）和Kolmogorov检验（Dn）】的结果确定最优模型，估算最适合模型的主基因和多基因效应值、遗传率等一阶遗传参数和二阶遗传参数。

发病初期开始调查病情，按YC／T39－1996行业标准进行调查，分别调查三次。分级标准，0级：全株无病；1级：茎部偶有褪绿斑，或在有条斑一侧有少数叶片凋萎；2级：茎部有黑色条斑，但尚未达到顶部，或病侧半数以上叶片凋萎；3级：茎部黑色条斑到达植株顶部，或病侧三分之二以上叶片凋萎；4级：烟株基本枯死。

病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高级值）×100

2 结果与分析

2.1 完全双列杂交后代的病情指数

完全双列杂交后代的平均病情指数见表1，大叶密合与长脖黄、谷嘴、封开-10正反交F1的病情指数偏向感病品种，NC95与长脖黄、谷嘴、封开-10正反交F1的病情指数接近亲本中值。

表1 完全双列杂交后代的病情指数Tab.1 Disease index of each cross for bacterial wilt

2.2 配合力分析

2.2.1 配合力方差分析

从表2中可以看出，一般配合力方差达到极显著水平，特殊配合力达到显著水平；一般配合力方差远大于特殊配合力方差，二者比值为34.0，表明在参试品种的青枯病抗性中加性效应是主要的，显性效应处于次要地位。反交效应未达到显著水平，表明参试品种的青枯病抗性主要受细胞核效应的影响。

表2 亲本抗病性配合力的方差分析Tab.2 Variance analysis of resistance combining ability of pare nt sample

2.2.2 一般配合力效应的估算

对各亲本的一般配合力的效应值进行差异显著性分析（表3），结果表明：谷嘴与封开－10、大叶密合与岩烟97的效应值差异不显著，其他亲本的效应值差异达极显著水平。病情指数与抗病性是反向指标，病情指数越小说明其抗病性越强。6个亲本中，NC95、岩烟97和大叶密合具有较高负值的一般配合力效应值，较适宜作为抗病亲本；封开－10、谷嘴和长脖黄具有较高的正效应值，不适宜作为抗病亲本。

表3 一般配合力效应差异显著性测验及比较Tab.3 Test and comparison of general combining ability effect of resistance ability

2.3 双列杂交 Hayman法分析

根据各亲本和杂交组合后代病情指数间的方差(Vr)、协方差(Wr)，画出回归直线（图1）。依据各亲本在（Wr，Vr）回归图形上的位置，可以推断亲本中显隐性基因的分布。有较多显性基因的亲本具有较低的（Wr，Vr）值，位于回归线的左下方，而有较少显性基因的亲本具有较大的（Wr，Vr）值，位于回归线的右上方。从图1可以看出，大叶密合与其他品种的（Wr，Vr）值差异较大，表明其具有较少的显性基因。

图1 Wr/Vr回归图Fig.1 Regression of disease index covariance Wr on series varia nce Vr

2.4 大叶密合、长脖黄及其F1和F2 4世代青枯病发生情况

各世代病情指数见表4，大叶密合×长脖黄的F1、F2群体的病情指数接近感病品种长脖黄而大于双亲的平均病情指数；经方差分析，大叶密合与长脖黄、F1的病情指数达极显著差异，F1与长脖黄的病情指数无显著差异。大叶密合×长脖黄 F2的表型分布呈现偏态分布（表5），推测该组合的青枯病抗性存在主效基因的作用。

表4 大叶密合、长脖黄及其 F1、F2病情指数Tab.4 Disease index of Dayemihe、Changbohuang and hybrid combination F1、F2 of two varieties

表5 大叶密合、长脖黄及其F1、F2发病级别的次数分布Tab.5 Disease distribution of Dayemihe、Changbohuang and hybrid combination F1、F2 of two varieties

2.5 遗传模型选择与遗传参数的估计

利用亲本、F1重复试验平均数和F2家系4个世代群体进行主基因＋多基因混合遗传分析，各模型的AIC值见表6。大叶密合×长脖黄组合中遗传模型E-1、E-0和D-0的AIC值相对较小，由适合性检验结果（表7）可知，E-0模型有5个参数达到显著或极显著差异，D-0模型有4个参数达到显著或极显著差异，而E-1模型只有3个参数达到显著或极显著差异，E-1为最佳遗传模型，即2对加性-显性-上位性主基因＋加性-显性多基因模型。

根据遗传模型中成分的分布和相应的均值求得一阶遗传参数和二阶遗传参数（见表8）。大叶密合×长脖黄组合的2对主基因加性效应值分别为0.5013和-0.3023,第一对主基因加性效应值是第二对主基因的1.66倍，两对主基因加性效应方向相反，正负效应相互抵消，但总和为正效应。显性效应值分别为1.6439和0.8401，第一对主基因显性效应值是第二对主基因的1.96倍。2对主基因互作效应较明显，加性×加性效应（i）为-0.8404，显性×显性效应值（l）为-0.9364，第1对主基因的加性效应与第2对主基因的显性效应的互作效应（jab）为0.3026，第2对主基因的加性效应与第1对主基因的显性效应的互作效应（jba）为0.3023。加性效应值（da+db）、显性效应值（ha+hb）和上位性效应值（i+jab+jba+l）分别为 0.199、2.484、-1.1719，从效应值的大小看，加性效应不明显，以显性效应为主，存在上位性效应。大叶密合×长脖黄组合抗性遗传还存在多基因修饰，多基因加性效应值[d]和显性效应值[h]分别为-1.3989和-1.7798。该组合分离世代F2群体青枯病抗性主基因遗传方差（σmg2）为0.7096，主基因遗传率（hmg2）为63.95%，表明该组合的抗性遗传以主基因为主；多基因遗传率（hpg2）为0，其原因可能是多基因遗传方差相对较小，环境对该组合的抗性表达影响较大。

表6 大叶密合×长脖黄组合青枯病抗性在不同遗传模型下的极大对数似然函数值与AIC值Tab..6 Maxinum likelihood value (MLV) and Akaike’ s information criterion (AIC) for resistance to bacterial wilt in the cross of Dayemihe×Changbohuang under different genetic models

表7 大叶密合×长脖黄组合青枯病病情不同遗传模型的适合性检验结果Tab.7 Tests on goodness-of-fit of genetic models for resistanc e to bacterial wilt in the cross of Dayemihe×Changbohuang

续表7

表8 有关遗传参数估计值Tab.8 Estimated value of genetic parameters for resistant gene under the E-1 model

3 讨论

不同烟草种质资源对青枯病的抗性遗传存在差异，材料、鉴定方法和病原菌的选择差异也可能造成抗性研究结果的差异。Smith 和Clayton（1948）[1]用低抗品种Davis Special 和 Pinkney Arthur杂交，其F1代几乎完全感病，但从杂种后代中选出的株系DSPA的抗性比双亲都高；对TI448A、79X等抗源的研究表明烟草青枯病抗性由隐性多基因控制。Jack等 CORESTA青枯病研究协作组（2002）研究认为抗性来源于TI448A的品种NC95表现为多基因的加性遗传[4]。范江等（2013）[15]以抗青枯病的烟草品种Oxford207、感病品种红花大金元为亲本，构建了F1、F2和BC1群体，并采用苗期恒温水培接种法鉴定了群体青枯病的抗性，表明Oxford207的青枯病抗性不符合典型的显性或隐性基因控制模型，属于加性基因控制。杨友才等（2005）[14]通过使用强致病力的单一菌株，对烟草抗性资源TI448A的抗性遗传机理进行了研究，结果表明其抗性受显性单基因控制。Matsuda和Ohashi(1973)[7]报道Awa、Hatano、Kokubu与O-damma等中抗品种的抗性受部分显性基因Rps控制，高抗品种Enshu、Hatanodaruma的抗性不仅受Rps基因控制，还受多基因影响，Xanthi的抗性是由部分显性基因Rxa控制，Sumatra C的抗性由部分显性基因Rps和多基因控制。高加明等（2010）[13]以香料烟青枯病抗病品种Xanthi，感病品种Samsun，F1以及F2群体为研究材料，结果表明香料烟青枯病抗性基因是受2对加性-显性-上位主基因+加性-显性多基因(E-1模型)控制遗传。孙学永等（2013）[16]选用15份对烟草青枯病抗性程度不同的烟草种质，应用完全双列杂交方法配制组合，结果表明：烟草青枯病抗性以加性效应为主，显性效应不明显，存在加性×加性上位性；加性及其上位性与环境有互作效应。

大叶密合与感病品种长脖黄杂交F1的病情指数接近感病品种,NC95与感病品种长脖黄杂交F1的病情指数接近亲本中值。说明大叶密合与NC95的抗性遗传存在差异，NC95的抗性表现为加性遗传，与CORESTA 青枯病研究协作组（2002）[4]和范江等（2013）[15]的研究结果一致。岩烟97是以G80作轮回亲本与(401-2×G80)F1回交,经系谱法选育出的烤烟品种[17]，根据其系谱，推测其青枯病抗性来源于TI448A，抗性遗传与NC95相似。

大叶密合是在广东省封开县主栽晒黄烟品种中叶片较宽大的农家种，在当地种植多年，品质好，为名优晾晒烟品种之一，当地大田表现青枯病抗性较强。近年来，对大叶密合的青枯病抗性进行多点、多年的鉴定，发现其抗性较强[8]，大叶密合、长脖黄及杂交F1在本研究中连续2年的发病情况基本一致，抗性表现稳定性较好。从大叶密合、长脖黄及其F1、F2群体病情指数来看，F2群体在发病前、中期比F1更趋向于感病，可能与大叶密合的抗性遗传及环境因素有关，后代分离群体单株要表现为抗病须集成较多的抗病基因。

4 结论

遗传分析结果表明，大叶密合的青枯病抗性表现为细胞核遗传，符合2对加性-显性-上位性主基因＋加性-显性多基因遗传模型（E-1）；从主基因效应值的大小看，加性效应不明显，以显性效应为主，存在上位性效应；主基因遗传率较低，利用大叶密合进行抗病育种，适宜在分离晚世代进行选择并加大后代筛选群体。

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Genetic analysis of resistance to bacterial wilt of tobacco cv.Dayemihe

ZHANG Zhenchen1,2，LYU Yonghua3，MA Zhuwen1,2，XIE Ruihong1,2，LI Jiqin1,2，YUAN Qinghua1,2，LI Shuling1,2，LYU Jinjin1,2，CHEN Junbiao1,2
1 Crops Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510640,China;
2 Guangdong Provincial Key Laboratory of Crops Genetics and Improvement,Guangzhou 510640,China;
3 Guangdong Provincial Tobacco Company,Guangzhou 510610,China;

A 6×6 diallel cross of six tobacco varieties with different resistance to bacterial wilt (Ralstonia solanacarum) was made.Genetic analysis was conducted by Griffing–I and Hayman' s method.Inheritance of resistance to bacterial wilt in tobacco in P1,P2,F1 and F2 from the cross Dayemihe (resistant，Chinese domestic variety) × Changbohuang (susceptible，Chinese domestic variety) was investigated by the mixed major gene plus polygene inheritance model of quantitative traits.Results indicated that the resistance to bacterial wilt in tobacco was controlled by nucleolus inheritance.The resistant genes parents were different.Resistance of the cross Dayemihe ×Changbohuang was controlled by two adding-dominance-epistatic major genes plus adding-dominance polygene model.Effect of 2 main genes on addition and domination was 0.5013、-0.3023 and 1.6439、0.8401 respectively while that of polygene was -1.3989 and -1.7798.The heritability of major gene was 63.95%.

tobacco;varieties;bacterial wilt;resistance;genetic analysis

张振臣，吕永华，马柱文,等.烟草品种“大叶密合”青枯病抗性遗传分析[J].中国烟草学报，2015,21（3）

广东省科技计划项目（2010B020302004）；广东省科技基础条件建设项目(2013B060400034)；广东省烟草专卖局（公司）科技项目（201403）；广东省烟草专卖局（公司）科技项目（201106）；广东省农业科学院院长基金项目（201408）

张振臣（1977—），高级农艺师，主要从事烟草遗传育种研究，Tel：020-87596595；Email：zhangzhenchen163@163.com

陈俊标 （1963—），副研究员，主要从事烟草资源与遗传育种研究，Email：jbchen2007@126.com

2014-03-20

：ZHANG Zhenchen,LYU Yonghua,MA Zhuwen,et al.Genetic analysis of resistance to bacterial wilt of tobacco cv.Dayemihe[J]Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)