液相色谱串联质谱法测定再造烟叶中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物

黄华发，张建平，黄朝章，谢卫，邓其馨，吴清辉，刘秀彩，叶仲力，刘泽春

福建中烟工业有限责任公司技术中心，厦门集美滨水路298号361021

液相色谱串联质谱法测定再造烟叶中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物

黄华发，张建平，黄朝章，谢卫，邓其馨，吴清辉，刘秀彩，叶仲力，刘泽春

福建中烟工业有限责任公司技术中心，厦门集美滨水路298号361021

建立了液相色谱串联质谱测定再造烟叶中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物的方法。样品用甲醇做萃取剂，经涡旋振荡，C8液相色谱柱分离，串联质谱仪MRM模式检测。结果发现，在0.05～l0mg/L范围内线性良好，定量限分别为2.5 μg/L、2.8 μg/L，回收率分别为95.2%、92.3%，相对标准偏差<5%。该方法操作简单、效率高、适合推广运用。

液相色谱质谱串联法；再造烟叶；甲基异噻唑啉酮；甲基氯异噻唑啉酮

甲基异噻唑啉酮及其氯代物，俗称卡松，活性成分为5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(甲基氯异噻唑啉酮，CMI)、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(甲基异噻唑啉酮，MI)，结构示意图如图1所示。广泛用于化妆品、个人护理品、涂料等行业，作为防腐杀菌剂，保护产品免受微生物污染，延长产品寿命[1-2]。

图l 2种异噻唑啉酮类防腐剂的结构示意图Fig.1 Structural representation for MI and CMI

但是，暴露在甲基异噻唑啉酮类的环境中会存在健康隐患。研究发现甲基异噻唑啉酮类具有一定的细胞毒性和神经毒性，与皮肤接触会产生过敏反应，吸入、不慎吞咽对人体有害[3-5]。我国《化妆品卫生规范》（2007年版）中规定甲基异噻唑啉酮在化妆品中最大允许使用浓度为0.01%[6]。

再造烟叶在使用的过程中为了防止霉变，减少损失，也可能在其中加入了甲基异噻唑啉酮及其氯代物，而在卷烟燃烧过程中进入人体，对人体产生危害。因此，对再造烟叶中的甲基异噻唑啉酮类的含量进行测定和限定是十分必要的。

目前，对甲基异噻唑啉酮类的检测方法主要有分光光度法[7]、气相色谱法[8]、气相色谱质谱联用法[9]、液相色谱[10-14]]和液相色谱质谱联用法[15]。其中，液相色谱质谱串联法更适用于高沸点或热稳定性差等物质的分离检测，同时随着色谱技术的不断发展，仪器普及率也较高，样品预处理也相对简单。因此，本文采用甲醇做萃取剂，经涡旋振荡，C8液相色谱柱分离，串联质谱仪MRM模式检测，外标法定量的方式，建立适用于再造烟叶中甲基异噻唑啉酮及其氯代物的定量分析检测方法，为卷烟安全性评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

实验所用再造烟叶样品分别由福建金闽、广东金科、云南瑞升公司提供，按YC/T 31制备样品并测定水分。

5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮标准品（纯度>98.2%，Dr Ehrenstorfer GmbH），2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮标准品（纯度>99.5%，Dr Ehrenstorfer GmbH），避光贮存于0℃～4℃条件下；色谱纯丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲醇；分析纯无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠；N-丙基乙二胺键合固相（PSA）吸附剂、碳18（C18E）吸附剂、石墨化炭黑（GCB）吸附剂（均购自美国Supelco公司）；水（符合GB/T6682中一级水的规定）。

Agilent1290高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AB5500三重四级杆质谱仪( 美国 Applied Biosystems SCIEX公司， 配备电喷雾离子源（ESI）)；VX-200漩涡混合振荡仪（美国Labnet公司）；Sigma1-14高速离心机（德国Sartorius公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；AG104型电子天平（感量：0.0001 g，瑞士METTLER TOLEDO公司）。

1.2 仪器条件

LC条 件：进样量：5μL；色谱柱：Agilent ZORBAX 300SB-C8（规格为 2.1×100 mm,1.8 μm）；流动相：A：甲醇，B：水；梯度洗脱程序：0～4min甲醇：水=2:8，4～6min甲醇：水=9:1，6～8min甲醇：水=2:8，流速：250 μL/min，柱温：40℃。

MS/MS条件：电喷雾正离子扫描(ESI(+))；电压为4 000 V；碰撞气为高纯氮气，碰撞气压力为0.20 Pa(1.5 mTorr)；鞘气为氮气，压力为6.00kPa(45 Torr)；毛细管温度为350 ℃；监测模式为多级反应监控(multiple reaction monitoring,MRM)模式，质谱采集参数见表1。

表1 质谱采集参数Tab.1 MS/MS acquisition parameters

1.3 标准曲线

分别准确称取10 mg(精确至0.1 mg)甲基异噻唑啉酮及其氯代物标准品于100 mL容量瓶中，以甲醇定容，配成质量浓度为100 mg/L的标准储备液；准确移取不同体积的标准储备液，以甲醇稀释，得到质量浓度均为0.05、0.l0、0.50、1、5、l0 mg/L的系列混合标准溶液。

1.4 试样处理

称取约2 g样品于50 mL具盖离心管中，精确至0.1 mg，加入10 mL水，振荡直至样品被水充分浸润，静置10 min。

移取10 mL甲醇到离心管中，并置于漩涡混合振荡仪上以2000 r/min速率振荡2 min。

在离心管中分别加入4 g无水硫酸镁，1 g氯化钠，1 g柠檬酸钠，0.5 g柠檬酸氢二钠，立即于漩涡混合振荡仪上以2000 r/min速度振荡2 min，以防止无水硫酸镁遇水反应造成局部过热并结块，然后以4000 r/min离心5 min。

移取1.5 mL样品提取液上层清液于2 mL离心管中，加入150 mg无水硫酸镁、50 mgN-丙基乙二胺键合固相（PSA）吸附剂，于漩涡混合振荡仪上以2000 r/min 速率振荡2 min，以4000 r/min 离心5 min，收集上清液，待检测分析。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件

MI和CMI的结构中均有含氮基团，有利于结合质子得到正离子，因此选择正离子模式进行检测。将质量浓度为5.0 mg/L的MI和CMI标准品通过注射泵引入离子源，在不加碰撞气压力的情况下进行一级质谱分析(Qt扫描)，结果表明这2种化合物的最强峰均为其准分子离子峰，因此选择准分子离子[M+H]+为母离子，通过优化喷雾电压、离子传输管温度、鞘气压力、辅助气压力、透镜补偿电压等参数使得母离子强度最大。之后选择碰撞气压力0.20 Pa，分别对分子离子进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片的离子信息，找到强度较大的3个子离子，优化其碰撞能量，其中强度最大的一个子离子用作定量离子，另外两个用作定性离子，得到的特征子离子和碰撞能量信息如表1所示。

2.2 液相色谱条件的选择

C-18和C-8硅烷色谱柱是高效液相色谱（HPLC）中最常使用的色谱柱。MI和CMI极性大，采用正相极性柱需要很长的分离时间，由于本方法采用三重四级杆质谱MRM模式进行检测，对色谱分离的要求较低，同时为了缩短检测周期，因此最终采用反相非极性C8色谱柱为固定相。

分别选择不同配比水相、有机相进行比较，选用不同比例甲醇、水、乙腈作为流动相对试样进行分离检测，实验结果表明：选用甲醇和水作为流动相比用乙腈、水作为流动相或甲醇、水、乙腈混合流动相，分离效果更好、色谱峰更尖锐。因此选用甲醇、水作为为流动相；同时采用梯度洗脱程序：在MI和CMI出峰后，调高流动相中甲醇的比例，加快其它杂质峰的洗脱，减少流动相消耗。MI和CMI的MRM色谱图如图2所示。

图2 MI和CMI的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatogram for MI and CMI

2.3 样品前处理方法的优化

2.3.1 萃取剂的选择

研究表明，由于再造烟草样品为含水率低的粉末，采用一定量的水润湿有利于MI和CMI的提取。进一步的实验发现，为了将2 g的烟末完全润湿，水的体积大致在10 mL左右。

经查阅文献[10-15]表明，MI和CMI一般采用丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、水等溶剂定容，实验分别采用丙酮、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、水和甲醇对再造烟叶进行萃取。结果如图3所示，MI和CMI在水和醇类中溶解度较好，综合考虑，我们选择甲醇作为提取溶剂。进一步的实验发现，当称样量为2g、萃取剂甲醇的体积为10 mL时萃取效果最好。

图3 不同溶剂的萃取效率Fig.3Extraction efficiency of different solvents

2.3.2 提取方式的选择

采用不同的提取方式，一般不会对自由态提取目标的回收率造成影响，只会存在提取时间的差异。漩涡振荡是一种新兴的提取方式，其振荡频次可达到2000 rpm，是普通旋转振荡的10倍，极大地缩短了振荡时间、提高了萃取的效率，并被QuEChERS前处理方法所采纳。因此，本文最终选用了漩涡振荡来作为提取方式，而进一步的实验摸索发现2 min的振荡时间已能使提取达到完全。

2.3.3 缓冲盐体系的选择

在QuEChERS前处理方法中，常用的盐析试剂包有：

A：4gMgSO4+ 1gNaCl（无缓冲盐）

B：4gMgSO4+ 1gNaCl + 1gNa3Cit·2H2O + 0.5gNa2HCit·1.5H2O（柠檬酸缓冲盐体系）

C：4gMgSO4+ 1gNaOAc（醋酸缓冲盐体系，提取溶剂中要加入1%体积的醋酸）

对不同的盐析试剂包进行比较，结果发现：C盐析试剂包回收率最低，A盐析试剂包结果不稳定，B盐析试剂包回收率最高。因此，本文最终选用了柠檬酸盐缓冲体系。

2.3.4 净化吸附剂的选择

在QuEChERS前处理方法中，常用的净化剂有PSA、C18E、GCB等。对不同净化剂进行考察，结果如图4所示：PSA的净化效果较好，且回收率较高。因此，本文最终选择PSA作为净化剂。

图4 不同净化剂的回收率比较Fig.4 Recovery rate comparison of different purification agent s

2.3.5 标液及样品稳定性

考察放置时间、温度等对甲基异噻唑啉酮及其氯代物检测的影响，结果发现：甲基异噻唑啉酮及其氯代物化学性质比较稳定，温度及时间对测定结果影响不大。

2.4 方法的验证

2.4.1 线性关系

配制MI、CMI质量浓度均为0.05、0.l0、0.50、1、5、l0 mg/L的系列混合标准溶液，并对其分别进行测定，以目标物的峰面积Y，对其质量浓度X(mg/L)进行回归分析，得到MI、CMI的线性回归方程，结果如表2所示。按信噪比(S/N)大于10来确定MI和CMI的仪器定量限分别为 2.5 μg/L、2.8 μg/L。

表2 M1和CMI的线性回归方程和决定系数Tab.2 Linear regression equation and coefficient of determinat ion for M1 and CMI

2.4.2 重复性实验

为了考察方法的重复性，对一样品重复测定，重复做3天，每天进行了6次平行测定，结果如表3、4所示，相对标准偏差(RSD)小于5%。

表3 MI重复性试验Tab.3 Repetition test of MI

表4 CMI重复性试验Tab.4 Repetition test of CMI

2.4.3 回收率实验

在同一样品中，按样品质量加入3个浓度水平的标样，混匀，各测定3次，结果如表5、6所示，回收率分别为95.2%、92.3%，符合化学检测要求。

表5 MI回收率试验Tab.5 Recovery rate test of MI

表6 CMI回收率试验Tab.6 Recovery rate test of CMI

2.4.4 样品的测定

按上述方法对20个再造烟叶样品进行检测，结果如表7所示，在部分样品中检出了甲基异噻唑啉酮及其氯代物，检出率为30%，检测值分别在0.314～4.589 mg/kg和0.286～2.365 mg/kg之间。并与常规的HPLC/PDA检测方法进行比对试验，两组检测结果经t检验后发现：t（MI）=0.479<1.812、t（CMI）=0.254<1.812 (置信区间小于0.05)，说明两种检测方法无显著性差异；但是采用HPLC/PDA方法在9#、12#、17#、18#样品中出现的目标峰经UPLC/MS/MS方法确认为假阳性，说明UPLC/MS/MS法测定再造烟叶中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物较HPLC/PDA法更为可靠。

表7 部分有检出的样品检测结果Tab.7 Test results of some samples

3 结论

以QuEChERS为样品前处理方法，建立了HPLC/MS/MS法测定再造烟叶中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物的方法。该方法线性良好，决定系数r2>0.99，回收率分别为95.2%、92.3%，RSD<5%。

采用该方法在部分样品中检出了甲基异噻唑啉酮及其氯代物。该方法填补再造烟叶中甲基异噻唑啉酮及其氯代物检测的技术空白，且操作简单、效率高、适合应用。

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Determination of Methylisothiazolinketone and its chlorides in reconstituted tobacco by HPLC/MS/MS

HUANG Huafa,ZHANG Jianping,HUANG Chaozhang,XIE Wei,DENG Qixin,WU Qinghui,LIU Xiucai,YE Zhongli,LIU Zechun

Technology Center of China Tobacco Fujian Industrial CO.,Ltd.,Xiamen 361021,Fujian,China

A HPLC/MS/MS chromatography method for the determination of methylisothiazoketone and methyl chloroisothiazole morphlinone in reconstituted tobacco was developed.Samples were extracted with methanol,separated on C8 column,and then detected by HPLC/MS/MS under MMR model.Good linearity was obtained between 0.05～l0 mg/L.,and the limits of detection were 2.5 μg/L for MI and 2.8 μg/L for CMI,and RSD was <5% and the recoveries were 95.2% for MI and 92.3% for CMI.The method proved simple,fast,accurate,reliable，and applicable to quantitative analysis．

HPLC/MS/MS；reconstituted tobacco；Methylisothiazolinketone；Methylchloroisothiazole Morphlinone

黄华发，张建平，黄朝章,等.液相色谱串联质谱法测定再造烟叶中的甲基异噻唑啉酮及其氯代物[J].中国烟草学报，2015,21（3）

黄华发（1983—），本科，工程师，主要从事烟草化学研究，Tel：0592-3170716， Email:hhf10520@fjtic.cn

刘泽春（1976—），硕士，高级工程师，主要从事烟草化学研究，Tel：0592-3170718，Email:lzc10497@fjtic.cn

2014-12-17

: HUANG Huafa,ZHANG Jianping,HUANG Chaozhang,et al.Determination of Methylisothiazolinketone and its chlorides in reconstituted tobacco by HPLC/MS/MS [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)