GC-MS法分析不同部位仿野生与组培快繁铁皮石斛中的挥发性成分

付 涛， 王志龙

（宁波城市职业技术学院，浙江宁波315502）

GC-MS法分析不同部位仿野生与组培快繁铁皮石斛中的挥发性成分

付 涛， 王志龙*

（宁波城市职业技术学院，浙江宁波315502）

目的 分析仿野生与组织培养快速繁殖 （组培快繁）铁皮石斛茎、根和叶中的挥发性成分。方法 铁皮石斛茎、根和叶液氮研磨成粉，气质联用 （GC-MS）仪分析提取液中的成分和其相对含有量。结果 铁皮石斛中共鉴定出90种挥发成分，主要为醛类、醇类、酯类、萜烯类、酮类、烷烃与芳香烃及其衍生物。其中，仿野生鉴定出72种，茎中24种、根中29种、叶中19种；组培快繁鉴定出68种，茎中23种、根中29种、叶中16种。其共有成分在茎中有11种，根中有10种，叶中有5种。此外，萘在铁皮石斛不同部位中的含有量都较高。结论 仿野生与组培快繁铁皮石斛不同部位中挥发性成分的差异很大。

铁皮石斛；仿野生；组培快繁；挥发性成分；茎；根；叶；GC-MS

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科石斛属多年生草本植物，分布于浙江、安徽、福建、湖南、广西、四川和云南等地，又名“耳环石斛”，是我国名贵中药材，在道家养生经典 《道臧》中被誉为中华九大仙草之首，药用价值远高于人参、鹿茸、灵芝等，在民间有 “仙草”

的美誉。铁皮石斛含多糖、生物碱、联苄衍生物、菲、黄酮、氨基酸、微量元素等成分，有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗白内障、抗衰老、抗菌等多种生物活性［1-6］。由于该植物对生长条件要求十分苛刻，加上人为长期无限制、掠夺性和毁灭性地采挖及不合理利用，近年来其野生资源已濒临绝迹，已被列入珍稀野生药用植物［7］，现已采用组培快繁技术对其进行繁殖，市场上销售的多为组培快繁品种。随着生活水平的提高，人们也逐渐开始关注养生问题，野生铁皮石斛价格十分昂贵，药效显著，市场上对其需求量很大。目前，根据不同地区资源、气候等特点，已有铁皮石斛仿野生的不同种植模式，是很多科研人员、农民或企事业单位员工正探索的工作，仿野生种植铁皮石斛势在必行。

浙江省是野生铁皮石斛的分布地之一，如东部的鄞县、天台、仙居等。根据生长习性，铁皮石斛栽培地宜选择海拔100～1 000 m，年降雨量1 100～1 500 mm，生长季节温度 20～25℃、冬季气温-3℃以上，相对湿度75%以上，无霜多雾，林间郁闭度0.6左右的阴凉、湿润的常绿阔叶林。宁波奉化市溪口地区地处沿海、江南，四面环山，树林覆盖率广，气候条件温暖湿润，年平均温度在15～20℃，年降水量在1 200～1 800 mm，土壤深厚肥沃，比较符合铁皮石斛仿野生种植的基本条件。

铁皮石斛全身都是宝，但目前除了茎之外，对该植物叶、根或花的研究报道较少，尚未大面积推广应用。铁皮石斛叶中含有少量石斛多糖、生物碱，可以起到降火消署的作用，目前已有人将其做成石斛叶茶，但加工不易，产量不理想；传统上，优质铁皮枫斗以外观 “龙头凤尾”者为优，其中 “尾”即为根，因此根部的营养成分并不亚于茎，但单独对根化学成分的研究鲜有于报道。近年来，由于GC-MS被广泛使用，不同植物中挥发性成分的研究如火如荼，其组成和含有量也逐渐成为评价植物品质优劣的一个重要指标。迄今为止，铁皮石斛挥发性成分的研究相对滞后，尤其是对不同部位 （根、茎和叶）中挥发性成分的关注更少。因此，本实验通过分析仿野生与组培快繁铁皮石斛不同部位中挥发性成分的差异，来评价两者的品质差异，为优质铁皮石斛的筛选提供重要的品质指标，而且对该植物资源的合理利用也具有十分重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 材料 仿野生、组培快繁铁皮石斛均为2年生，来自宁波城市职业技术学院温室大棚和仿野生种植基地 （经度121.40、纬度29.65）。道地铁皮石斛通过组培穴盘苗，选择健壮、无病虫害者，以2年生新茎作繁殖用，采用茎尖 （节）作为繁殖材料的无性繁殖途径。组培苗2个月后再经露地炼苗2个月，移栽到穴盘中，半年后将部分穴盘苗移植到温室大棚的容器花盆中，进行组培快繁管理，而另一部分进行仿野生种植。组培快繁需要定期浇水、追肥、整枝等，此外每月还要喷适量杀菌剂以防治病虫害；仿野生种植不施肥、不用农药，但若空气湿度过小，则需浇水保湿。

1.2 主要试剂与仪器 氯化钠为分析纯；液氮。HP7890B GC system/5977A MSD GC-MS联用仪（美国安捷伦科技公司）；手动固相微萃取装置，萃取纤维为7.5μm CAR/PDMS（美国Supleco公司）；Mettler Toledo电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MLLI-Q-超纯水仪（美国Millipore公司）；加热磁力搅拌器；液氮罐。

1.3 方法

1.3.1 固相微萃取（SPME）条件 分别选取2年生仿野生和组培快繁铁皮石斛的茎、叶和根，液氮研磨成粉，迅速称取5 g左右，装入固相微萃取专用采样瓶中，加入超纯水2 m L，插入装有7.5μm CAR/PDMS纤维头的手动进样器，磁力搅拌速度为1 000 r/min，60℃下顶空萃取40 min后取出，快速插入色谱仪进样口 （250℃）中，解吸附5 min。

1.3.2 GC条件 色谱柱为Agilent 19091S-433：93.92873 HP-5MS 5%Phenyl Methyl silox-60℃-325℃（30 m×250μm×0.25μm）；柱温50℃；进样口温度 250℃；柱内载气体积流量 1.0 mL/min；载气为高纯氦气 （99.999%）；汽化室温度250℃，柱前压7.62 psi；升温程序为从50℃开始，保持1 min，以4℃/min速率升至240℃，保持2 min；不分流进样。

1.3.3 MS条件 电子轰击离子源为EI；离子源温度230℃；接口温度250℃；电子能量70 eV；MS四级杆温度150℃；调谐EMV 1 149；溶剂延时2.6 min；扫描范围15～500 Amu。

1.4 数据处理 通过HP chemstation检索Nist05和wiley 275质谱图库，同时结合相关文献确认仿野生和组培快繁铁皮石斛茎、叶和根中的挥发性化学成分。然后，通过HP chemstation数据处理系统，按峰面积归一化法计算出各化学成分的相对百

分含有量。

2 结果

铁皮石斛中共检测到90种挥发性成分，包括醛类 （10种）、醇类 （13种）、酯类 （11种）、萜烯类 （13种）、酮类 （14种）、烷烃与芳香烃及其衍生物 （20种）和其他 （9种）；其中仿野生检测到72种，组培快繁检测到68种。仿野生茎中有24种，在这7类物质中分别占1、4、3、1、3、11和1种，而组培快繁茎中有23种，分别占4、5、 3、1、2、8和0种；仿野生根中有29种，分别占3、6、3、5、5、5和2种，而组培快繁茎中有29种，分别占4、5、1、4、6、7和2种；仿野生叶中有19种，分别占2、1、2、1、4、4和5种，而组培快繁叶中有16种，分别占2、2、5、1、2、3和1种。具体见表1和表2，仿野生和组培快繁铁皮石斛茎、根和叶中挥发性成分的总离子流色谱图见图1。

表1 仿野生与组培快繁铁皮石斛不同部位中挥发性成分的种类及相对含有量Tab.1 K inds and relative con tents of volatile constituents in d ifferent parts of im itative w ild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale

图1 仿野生和组培快繁铁皮石斛茎、根和叶中挥发性成分总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chrom atogram s of volatile constituents in stem s，roots and leaves of im itativew ild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale

表2 仿野生与组培快繁铁皮石斛不同部位中挥发性成分及其相对含有量Tab.2 Volatile constituents and their relative con tents in d ifferent parts of im itativew ild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale

续表2

续表2

2.1 相同部位挥发性成分种类以及主要成分含有量的比较 由表2可知，仿野生铁皮石斛茎中烷烃与芳香烃及其衍生物的含有量最高 （55.17%），其次是酯类 （27.76%）、醇类 （6.55%）、酮类（4.4%）、醛类 （3.97%）和萜烯类 （1.06%），其它占1.08%。其中，相对含有量最高的前5位依次是1，6-二 （丙炔氧基）己烷 （30.49%）、1，2-苯二甲酸二 （2-甲基丙基）酯 （14.44%）、萘（11.19%）、邻苯二甲酸二丁酯 （9.02%）和邻苯二甲酸双十二酯 （4.30%）；组培快繁茎中各类成分的含有量相对均衡，烷烃与芳香烃及其衍生物最高 （26.18%），其次是醇类 （23.71%）、酯类（17.89%）、酮类 （17.38%）、醛类 （13.11%）和萜烯类 （1.71%），其它成分无。其中，相对含有量最高的前5位依次是1-棕榈醇 （18.20%）、1-（4-溴化丁基）-2-氮已环酮 （15.11%）、萘（11.46%）、1，2-苯二甲酸二 （2-甲基丙基）酯（8.44%）和邻苯二甲酸二丁酯 （6.82%）。

仿野生铁皮石斛根中各类成分的含有量也相对均衡，烷烃与芳香烃及其衍生物最高 （25.00%），其次是醛类 （20.77%）、酮类 （20.00%）、醇类（14.45%）、萜烯类 （12.52%）、酯类 （3.70%），其它占3.55%。其中，相对含有量最高的前5位依次是萘 （12.51%）、2-十一烯醛 （10.30%）、赖百当-8（20），12，14-三烯 （9.01%）、1-（4-溴化丁基）-2-氮已环酮 （7.27%）和壬醛（6.07%）；组培快繁根中醇类的含有量最高（38.85%），其次是酮类 （20.19%）、烷烃与芳香烃及其衍生物 （17.20%）、醛类 （11.62%）、萜烯类 （9.61%）、酯类 （0.97%），其它占1.55%。其中，相对含有量最高的前5位依次是1-棕榈醇（26.87%）、 萘 （6.26%）、 2-十 一 烯 醛（5.32%）、9，9-二甲氧基二环［3.3.1］壬-2，4-二酮 （5.10%）和α-异甲基紫罗兰酮 （4.25%）。

仿野生铁皮石斛叶中醛类含有量最高（66.18%），其次是酮类 （14.36%）、烷烃与芳香烃及其衍生物 （6.22%）、醇类 （4.31%）、酯类（1.15%）、萜烯类 （0.41%）、其它占7.35%。其中，相对含有量最高的前5位依次是反式-2-己烯醛 （62.44%）、3，5-二叔丁基-4-羟基-2，4-环己二烯-1-酮 （9.68%）、萘 （4.53%）、环十二醇（4.31%）、反式-4-羰基己-2-烯醛 （3.74%）；组

培快繁叶中也是醛类的含有量最高 （58.64%），其次是酯类 （12.90%）、酮类 （10.10%）、烷烃与芳香烃及其衍生物 （9.72%）、醇类 （3.85%）、萜烯类 （3.12%），其它占1.62%。其中，相对含有量最高的前 5位依次是反式-2-己烯醛（52.89%）、反式-香叶基丙酮 （6.53%）、萘（6.23%）、反式-2-己烯苯甲酸酯 （5.86%）和壬醛（5.75%）。

2.2 相同部位共有成分含有量比较 由表可知，仿野生和组培快繁铁皮石斛茎中有11种共有成分（分别占总挥发性成分的50.30%、73.19%），为十三醛、1-棕榈醇、1，2-苯二甲酸二 （2-甲基丙基）酯、邻苯二甲酸二丁酯、1-（4-溴化丁基）-2-氮已环酮、萘、2-甲基-萘、1-亚乙基-1H-茚、2，6，10-三甲基-十二烷、1-（1，5-二甲基己基）-4-（4-甲代戊基）环己烷和2，6，10，14-四甲基十七烷，约占总数的一半，但含有量差异较大；两者根中有10种 （分别占58.07%、55.12%），为2，6-辛二烯-4，5-二醇、2-十一烯醛、反式-11，13-十四碳二烯-1-醇、1-棕榈醇、反式-香叶基丙酮、1-（4-溴化丁基）-2-氮已环酮、萘、1-亚乙基-1H-茚、2，6，10-三甲基十四烷和0-葵基羟胺，约占总数的1/3，具体种类成分差异较大；两者叶中有5种 （分别占74.82%、66.71%），为反式-2-己烯醛、L-α-萜品醇、二氢猕猴桃内酯、反式-β-紫罗酮和萘，约占总数的1/4～1/3，具体种类成分差异也较大。

2.3 不同部位共有成分含有量比较 由表可知，仿野生铁皮石斛茎、根和叶中成分的差异非常大，其茎与根有7种共有成分 （分别占总挥发性成分的33.60%、33.46%），为反式-9-十六碳烯醇、1-棕榈醇、1，2-苯二甲酸二 （2-甲基丙基）酯、1-（4-溴化丁基）-2-氮已环酮、萘、1-亚乙基-1H-茚和2，2′，5，5′-四甲基-1，1′-联苯；茎与叶有7种（分别占20.06%、15.52%），为环十二醇、反式-β-紫罗酮、顺式-香叶基丙酮、萘、2-甲基-萘、6-乙基-2-甲基癸烷和1，6：3，4-Dianhydro-2-deoxy-β-D-lyxo-hexopyranose；根和叶仅有1种（分别占12.51%、4.53%），为萘；茎、根和叶仅有1种（分别占11.19%、12.51%、4.53%），为萘。组培快繁铁皮石斛茎、根和叶中成分的差异也很显著，茎与根有5种 （分别占49.04%、41.92%），为2，6-辛二烯-4，5-二醇、1-棕榈醇、1-（4-溴化丁基）-2-氮已环酮、萘和1-亚乙基-1H-茚；茎与叶有4种（分别占22.88%、14.94%），为壬醛、1， 5-二甲基-1-乙烯基-4-己烯基丁酸酯、萘和1-亚乙基-1H-茚；根与叶有 4种 （分别占 14.70%、16.75%），为环十二醇、反式-香叶基丙酮、萘和1-亚乙基-1H-茚；茎、根和叶有 2种 （分别占14.89%、8.68%、7.66%），为萘和1-亚乙基-1H-茚。

3 讨论

杨柳等［8］采用正己烷蒸馏法，发现铁皮石斛茎中的挥发油成分主要为烷烃、酸、烯烃、酯、甾醇、二萜、蒽醌类等。康联伟等［9-10］采用固相微萃取法，发现其主要含醛、醇、酮、烯烃和酯烃类化合物，还指出铁皮石斛愈伤组织的主要挥发性成分是烯烃类物质，而试管苗则为一些醛类物质。邵进明等［11］采用固相微萃取法，发现2年生铁皮石斛茎、叶中的挥发性成分均含柠檬油精、壬醛、顺-3-己烯醇等。本实验结果表明，该植物中的挥发性成分主要包括醛类、醇类、酯类、萜烯类、酮类、烷烃类以及芳香烃及其衍生物等，这与先前研究基本一致，由于采取固相微萃取法，因此所得挥发性成分大多是低沸点化合物，而杨柳等［8］采用水蒸气蒸馏法，所得大多是较高沸点化合物。笔者先前也采用水蒸气蒸馏法对铁皮石斛试管苗不同部位进行了分析 （数据未公布），发现与杨柳等［8］非常类似，不含醛类等低沸点化合物。因此，采用不同的方法，其结果也不尽相同。

另外，仿野生 （72种）与组培快繁 （68种）铁皮石斛成分的种类相当，但具体成分和相对含有量差异较大。仿野生茎中烷烃类和芳香烃及其衍生物占绝大多数 （55.17%），酯类含有量较高，而其余成分较低；组培快繁无明显突出成分，相对平均，除萜烯类含有量较低外，其余成分均较高。两者根中除酯类物质含有量均较低外，其余成分均较高。两者叶中醛类物质占绝大多数 （分别为66.18%、58.64%），其中均以反式-2-己烯醛为最主要物质 （相对含有量分别为 62.44%、52.89%），其次为黄酮类、酯类物质，而其余成分均较低。由此可见，由于生长环境的差异，铁皮石斛不同部位中的挥发性成分也有很大差异，但总体而言，茎中挥发性成分以烷烃类以及芳香烃及其衍生物、酯类、醇类等为主；根中比较平均，但以黄酮类、醇类等为主；叶中则以醛类 （反式-2-己烯醛）为主。因此，本实验为铁皮石斛不同部位的合理利用提供了一定的理论基础，针对铁皮石斛茎、根和叶中挥发性成分的不同，可以对其进行合

理的应用，避免珍贵资源的浪费。

挥发性成分主要属于次生代谢产物，在植物体内含有量较少，因此受到环境等因素的影响较大，这也是仿野生和组培快繁相同部位挥发性成分差异较大的重要原因，但无论是仿野生还是组培快繁，其不同部位挥发性成分的差异也很悬殊，这可能是不同部位器官功能基因选择性表达的结果，亦可能与其物质运输、转运等有关，有待作进一步研究。本实验发现，萘在仿野生和组培快繁的茎、根和叶中均有，似乎也不受环境等因素的影响，而且含有量较高，均位于挥发性成分的前5位，可能与其抗性有紧密联系，因此可以把萘作为鉴定铁皮石斛的一种重要物质以供参考。C6醛或醇是植物遭受昆虫取食后诱导释放的一类物质，一般具有生物杀伤性能，可防止继续遭受昆虫的侵食，此外还具有抑菌、杀菌等作用［12］。仿野生叶中的 C6醛化合物（反式-2-己烯醛、反式-4-羰基己-2-烯醛，相对含有量分别为62.44%、3.44%）显著高于组培快繁（反式-2-己烯醛，52.89%），说明铁皮石斛叶在自然条件下更容易遭受昆虫侵食，其中C6醛化合物的合成显著提高，以提高其抗逆性和防御性。因此，叶还可加工制作成香皂、洗手液、洗衣粉等杀菌抑菌生活用品。

植物的特征香气成分是引起植物特有香味嗅感的物质，即使含有量很低，也对植物品质起着重要作用。Yang等［13］对蜂胶的研究表明，人体嗅觉对化合物气味的感知与其含有量和气味阈值都有关，含有量高的化合物可能由于气味阈值高而不易被感知［14］，譬如与植物青香味有关的反式-2-己烯醛，其阈值为0.02 mg/kg，微量时就可以感觉到它的存在，故一些含有量不是十分显著的化合物对铁皮石斛茎、根和叶气味的形成起到了一定作用。植物香气的产生非常复杂，可能是由几种主要特征香气成分决定的，也可能是由各种成分通过融合、叠加、掩盖等相互作用表现出来的［15］。无论是仿野生还是组培快繁，铁皮石斛茎、叶中挥发性成分的种类均明显高于叶，因此传统上以 “龙头凤尾”者为优有一定道理。由于生长环境的差异，铁皮石斛不同部位挥发性成分的种类和含有量均发生了较大的差异，可能与其对环境的适应性有关，但该植物中许多化学成分的功能尚不清楚，因此本地仿野生种植是否明显提高了铁皮石斛的品质需有待作进一步研究。

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Analysis of volatile constituents in different parts of im itativewild and tissue culture and rapid propagation of Dendrobium officinale by GC-MS

FU Tao， WANG Zhi-long*

（Ningbo City College of Vocational Technology，Ningbo 3155O2，China）

AIM To analyze the volatile constituents in stems，roots and leaves of imitative wild and tissue culture and rapid propagation of Dendrobium officinale.METHODS The stems，roots and leaves of imitative wild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale were ground to fine powder in liquid nitrogen，the analyses of extractswere carried out on gas chromatography-mass spectrum（GC-MS）.RESULTS Total 90 kinds of volatile constituents were identified in D.officinale，most of which were aldehydes，alcohols，esters，terpenes，ketones，alkanes，aromatic hydrocarbons and their derivatives.Among them，72 kinds were identified in imitative wild of D.officinale，containing 24，29 and 19 kinds in stems，roots and leaves，respectively，while68 kindswere identified in tissue culture and rapid propagation of D.officinale，containing 23，29 and 16 kinds in stems，roots and leaves，respectively.There were 11，10 and 5 kinds of common constituents in stems，roots and leaves，respectively.In addition，the contentof naphthalene was high in different parts of D.officinale.CONCLUSION There are considerable differences in volatile constituents in different parts of imitative wild and tissue culture and rapid propagation of D.officinale.

Dendrobium officinale；imitative wild；tissue culture and rapid propagation；volatile constituents；stems；roots；leaves；GC-MS

R284.1

A

1001-1528（2015）12-2702-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.028

2015-03-18

浙江省教育厅科研项目 （Y201533193）；宁波城市职业技术学院校内重点项目 （ZZX15064）

付 涛 （1988—），男，硕士，主要从事园林园艺植物育种研究。Tel：15728035334，E-mail：819969334@qq.com

*通信作者：王志龙 （1971—），男，教授，主要从事植物资源保护教学与研究。Tel：（0574）88861001，E-mail：wangzhl01@163.com