LC-MS-MS法同时测定黄芪注射液和黄芪口服液中5种成分

储继红， 李长印， 戴国梁， 居文政

（南京中医药大学附属医院临床药理科，江苏南京210029）

［质 量］

LC-MS-MS法同时测定黄芪注射液和黄芪口服液中5种成分

储继红， 李长印， 戴国梁， 居文政*

（南京中医药大学附属医院临床药理科，江苏南京210029）

目的 建立LC-MS-MS法同时测定黄芪注射液和黄芪口服液中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素5种有效成分的含有量。方法 黄芪注射液和黄芪口服液甲醇稀释液在Agilent ZORBAX SB C18（2.1 mm×150 mm，5μm）色谱柱上分离，流动相为甲醇-水 （含0.1%甲酸，70∶30，V/V）；体积流量为300 μL/m in。MS采用电喷雾离子源，多反应监测方式进行正离子扫描。结果 5种成分在测定浓度范围内均具有良好的线性关系，在黄芪注射液和黄芪口服液中的平均回收率分别为96.8%～102.3%和95.9%～101.5%。结论 本法测得结果准确、可靠、灵敏度高，可用于黄芪注射液和黄芪口服液的质量控制。

黄芪注射液；黄芪口服液；黄芪甲苷；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；芒柄花苷；毛蕊异黄酮；芒柄花黄素；LC-MS-MS

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，主要含皂苷类、黄酮类、多糖类及氨基酸类等成分，性温，味甘，归肝、脾、肺、肾经，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、抗疮生肌等功效［1-3］。现代药学工艺的发展，使传统中药以新的剂型问世，黄芪注射液和黄芪口服液便是从黄芪

中提取有效成分制成的制剂，可增强心肌收缩力，扩张冠状动脉，保护心肌细胞，改善心脏功能；增加超氧化歧化酶活性，清除自由基；抑制血小板凝聚，降低血液黏稠度，改善微循环；增强肾上腺素皮质功能，改善肾脏功能；防止肝糖原减少，保护肝脏，在临床有广泛的应用［4-6］。

在黄芪制剂的质量控制方面，测定黄芪甲苷的方法比较多［3，7-13］。为了更全面的评价制剂质量，本实验采用LC-MS-MS法同时测定制剂中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素的含有量，为黄芪注射液和黄芪口服液质量标准的提高提供依据，也更符合中医药多组分、多靶点作用模式和整体性理论。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent6430 Triple Quad LC/MS（美国Agilent公司，MassHunter Workstation Sofeware，Version B.05.00），配有ESI源、1200型二元梯度泵和自动进样器；梅特勒MT-5电子天平；Biofuge PrimoR冷冻高速离心机；Drict-Q5超纯水机。

1.2 试药 黄芪甲苷 （批号0781-200311）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷 （批号111920-201102）和内标异鼠李素-3-0-新橙皮苷 （批号110860-200204），购自中国药品生物制品检定所；芒柄花苷 （批号120810）和毛蕊异黄酮 （批号120716），购自鼎瑞化工 （上海）有限公司；芒柄花黄素 （批号MUST-11050801），购自北京恒元启天化工技术研究院。黄芪口服液为江苏省中医院院内制剂 （10 mL/支）；黄芪注射液由正大青春宝药业有限公司生产 （10 mL/支）；甲醇为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 液相条件 Agilent ZORBAX SB C18（2.1 mm×150 mm，5μm）色谱柱；流动相为甲醇-水（含0.1%甲酸，70∶30，V/V）；体积流量300 μL/min；进样量2μL；柱温35℃。

2.2 质谱条件 ESI源，正离子模式检测；毛细管电压4 000 V；源温350℃；干燥气10 L/min；雾化气20 psi（1 psi=6.895 kPa）；扫描方式为多反应监测 （MRM）。用于定量分析的离子对分别为黄芪甲苷，［M+Na］+，m/z 807.5→807.5（fragmentor 220 V，collision energy 20 V）；毛蕊异黄酮葡萄糖苷，［M+H］+，m/z 447.1→285.1（fragmentor 110 V，collision energy 20 V）；芒柄花苷，［M+H］+，m/z431.2→269.0（fragmentor 110 V，collision energy 20 V）；毛蕊异黄酮，［M+H］+， m/z285.1→213.1（fragmentor 170 V，collision energy 40 V）；芒柄花黄素，［M+H］+，m/z 269.1→197.1（fragmentor 170 V，collision energy 40 V）；内标异鼠李素-3-0-新橙皮苷， ［M+H］+，m/z 647.3→331.3（fragmentor 130 V，collision energy 30 V）。

2.3 对照品溶液的配制 称取黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素适量，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液，4℃冰箱保存。

分别取上述对照品贮备液适量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1 mL含黄芪甲苷10.16μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.872μg、芒柄花苷1.044μg、毛蕊异黄酮0.661 4μg、芒柄花黄素0.251 6μg的混合对照品母液。

另称取异鼠李素-3-0-新橙皮苷适量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为内标贮备液，并用甲醇稀释至0.904 0μg/mL。

2.4 供试品溶液的配制 取黄芪注射液0.1 mL，用甲醇稀释20倍，即得。取黄芪口服液0.1 mL，用甲醇稀释200倍，取1 mL稀释液于1.5 mL塑料离心管中，13 800×g离心5 min，取上清液，即得。

各样品进样分析前，与0.904 0μg/mL内标异鼠李素-3-0-新橙皮苷甲醇溶液按体积比1∶1涡旋混合30 s，在 “2.1”和 “2.2”项条件下分析。

2.5 专属性试验 在本实验条件下，所测5种有效成分峰型良好无干扰，见图1。从图中可看出，毛蕊异黄酮 （峰5）的左侧有一个与毛蕊异黄酮葡萄糖苷 （峰3）保留时间一致的色谱峰，此峰是由毛蕊异黄酮葡萄糖苷产生，因为毛蕊异黄酮葡萄糖苷可先形成285.1的碎片离子，继而形成213.1的碎片离子。同样，芒柄花黄素 （峰6）左侧与芒柄花苷 （峰4）保留时间一致的色谱峰是由芒柄花苷产生的。

2.6 线性关系考察 精密吸取 “2.3”项下混合对照品母液适量，用甲醇稀释成系列浓度混合对照品溶液，与0.904 0μg/mL内标异鼠李素-3-0-新橙皮苷甲醇溶液按体积比1∶1涡旋混合30 s，在“2.1”和 “2.2”项条件下分析，以对照品质量浓度 （X）为横坐标，待测物峰面积As与内标峰面积Ais的比值 （Y）为纵坐标，作加权线性回归计算。结果表明，各成分在相应的线性范围内线性关系良好，各成分线性范围为黄芪甲苷0.079 4～

5.080μg/mL（r=0.997 9）；毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.029 2～1.872μg/m L（r=0.998 0）；芒柄花苷0.008 2～0.522 0μg/mL（r=0.999 2）；毛蕊异黄酮0.005 2～0.330 7μg/mL（r=0.999 6）；芒柄花黄素0.002 0～0.125 8μg/mL（r=0.999 7）。

图1 甲醇空白、混合对照品、黄芪注射液、黄芪口服液的LC-MS-MS图Fig.1 LC-MS-MS chromatograms of methanol，m ixed reference substances，Astragalus Injection and Astragalus O ral L iquid

2.7 精密度试验 取 “2.3”项下混合对照品母液适量，用甲醇稀释为含黄芪甲苷 0.635 0 μg/mL，毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.117 0μg/mL，芒柄花苷0.065 2μg/mL，毛蕊异黄酮0.041 3 μg/mL，芒柄花黄素0.015 7μg/m L的混合对照品溶液，在 “2.1”和 “2.2”项条件下连续进样5次，将峰面积比值代入当天标准曲线计算浓度，求得精密度。结果表明，仪器精密度良好，黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素的RSD值分别为3.1%、2.1%、3.4%、4.1%和4.5%。

2.8 重复性试验 分别取同一批号黄芪注射液（批号为 1212053） 和黄芪口服液 （批号为1304003），按 “2.4”项下方法制备供试品溶液5份，分别在 “2.1”和 “2.2”项条件下分析，测定各化合物的含有量。结果，黄芪注射液和黄芪口服液中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素的RSD值分别为3.3%和4.8%、3.8%和2.7%、4.7%和2.4%、4.9%和3.0%、4.2%和3.9%，表明方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 分别取同一批号黄芪注射液（批号为 1212053） 和黄芪口服液 （批号为1304003），按 “2.4”项下方法制备供试品溶液5份，在室温下放置0、2、4、8、12 h，在 “2.1”和 “2.2”项条件下分别进样分析，代入当天标准曲线计算浓度。黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花黄素的RSD值分别为3.3%和2.9%、2.6%和3.9%、2.9%和4.1%、4.2%和3.3%、3.5%和4.0%，表明样品溶液在12 h内稳定。

2.10 回收率试验 取成分含有量已知的同一批号黄芪注射液 （批号为1212053）0.1 mL，加入适当浓度混合对照品溶液0.1 mL，混匀，用甲醇稀释20倍。另取成分含有量已知的同一批号黄芪口服液 （批号为1304003）0.1 mL，加入适当浓度混合对照品溶液0.1 mL，混匀，用甲醇稀释200倍，取1 m L稀释液于1.5 m L塑料离心管中，13 800× g离心5 min，取上清液，分别平行制备5份。再

按体积比1∶1加入0.904 0μg/mL内标异鼠李素-3-0-新橙皮苷甲醇溶液涡旋混合30 s，在 “2.1”和 “2.2”项条件下分析，结果见表1、表2。

表1 黄芪注射液加样回收试验结果（n=5）Tab.1 Results of recovery tests for Astragalus Injection（n=5）

表2 黄芪口服液加样回收试验结果 （n=5）Tab.2 Results of recovery tests for Astragalus Oral Liquid（n=5）

2.11 样品测定 分别吸取3个批次的黄芪注射液和黄芪口服液，按 “2.4”项下方法处理，在“2.1”和 “2.2”项条件下分析测定，以内标法计算各成分的含有量，结果见表3。

表3 样品测定结果 （μg，n=3）Tab.3 Results of the determ ination of sam p les（μg，n=3）

3 讨论

据以往文献报道，对黄芪注射液和黄芪口服液的质量控制大多采用高效液相色谱法测定其中的黄芪甲苷［5-6，8］。由于中药是复杂体系，经多成分多途径协同作用发挥药效，因此建立多组分同时定量的分析方法，对全面控制中药制剂的质量具有重要意义。本实验采用LC-MS-MS法，对黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花黄素、芒柄花苷进行同时定量分析。由于黄芪甲苷 ［M+ H］+响应较差，故选择 ［M+Na］+模式，因［M+Na］+峰在二级质谱很难产生碎片离子，所以采用m/z807.5→807.5进行检测。其他4个化合物 ［M+H］+响应较好，二级质谱均有碎片离子。该方法专属性强，灵敏度高，分离效果理想，精密

度、重复性、稳定性、回收率均符合测定要求，有利于进一步完善黄芪注射液和黄芪口服液的质量控制及相关研究。

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Sim ultaneous determ ination of five com ponents in Astragalus Injection and Astragalus Oral Liquid by LC-MS-MS

CHU Ji-hong， LIChang-yin， DAIGuo-liang， JUWen-zheng*

（0 fficeof Clinical Pharmacology，Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM，Nanjing 21OO29，China）

AIM To establish an LC-MS-MS method for simultaneously determining the contents of astragaloside，calycosin-7-glucosid，ononin，calycosin and formononetin in Astragalus Injection and Astragalus Oral Liquid（Astragalusmembranaceus）.METHODS The determination of aforementioned components in Astragalus Injection and Astragalus Oral Liquid methnol diluents were performed on an Agilent ZORBAX SB C18（2.1 mm× 150 mm，5μm）with themobile phase consisting ofmethanol and water（containing 0.1%formic acid，70∶30，V/V）delivered at a flow rate of300μL/min.Electrospray ionization（ESI）interface and multiple reaction monitoring（MRM）were applied to the positive ion mode.RESULTS The five constituents demonstrated good linear relationships with their recoveries kept within the ranges of 96.9%-102.3%for Astragalus Injection and 95.9%-101.5%for Astragalus Oral Liquid.CONCLUSION Thismethod is accurate，reliable and sensitive，and can be used for the quality control of Astragalus Injection and Astragalus Oral solution.

Astragalus Injection；Astragalus Oral Liquid；astragaloside，calycosin-7-glucosid，ononin，calycosin，formononetin；LC-MS-MS

R927.2

A

1001-1528（2015）12-2647-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.016

2015-04-16

江苏省自然科学基金 （青年基金）项目 （BK20131035）；江苏省中医药领军人才项目 （LJ200906）；国家科技部 “重大新药创制”项目（2012ZX09303009-002）

储继红，女，助理研究员，研究方向为临床药代动力学。Tel：（025）86617141-50521，E-mail：cjh124@sina.com.cn

*通信作者：居文政，男，主任药师，研究方向为中药临床药代动力学。Tel：（025）86617141-50518，E-mail：juwz333@hotmail.com