清肺合剂的清除自由基和抗氧化作用

周俐斐， 芦柏震， 陈峰阳， 何福根， 何俏军

（1.浙江大学药学院，浙江杭州310058；2.浙江省肿瘤医院，浙江杭州310022；3.浙江省医学科学院药物研究所，浙江杭州310013）

清肺合剂的清除自由基和抗氧化作用

周俐斐1，2， 芦柏震2， 陈峰阳3， 何福根2， 何俏军1*

（1.浙江大学药学院，浙江杭州310058；2.浙江省肿瘤医院，浙江杭州310022；3.浙江省医学科学院药物研究所，浙江杭州310013）

目的 研究清肺合剂的清除自由基和抗氧化作用，从抗氧化应激角度探讨其治疗肺癌的机制。方法 采用DPPH、羟自由基和超氧阴离子自由基考察清肺合剂的清除自由基作用。采用总抗氧化能力、脂质过氧化水平和亚铁离子络合能力考察清肺合剂的抗氧化作用。结果 清肺合剂分别在0.13、0.26、1.05 mg/mL以上质量浓度对DPPH、羟基自由基和超氧阴离子自由基表现出剂量依赖性地清除作用。在0.26 mg/mL以上质量浓度表现出剂量依赖性的提高总抗氧化能力和抗脂质过氧化能力。在0.13mg/mL以上质量浓度能剂量依赖性地络合亚铁离子。结论 清肺合剂对DPPH自由基、羟基自由基以及超氧阴离子自由基具有较强的清除能力，还具有较强的总抗氧化能力，抗脂质过氧化能力和金属离子络合能力。

清肺合剂；肺癌；氧化应激

氧化反应为机体提供能量，是必不可少的生物过程。但是，当机体处于病理状态时，体内的抗氧化防御体系难以清除生物氧化过程产生的过多活性氧 （ROS），即会引起各种生物大分子的氧化应激损伤，包括蛋白质、脂质、DNA和RNA等，导致脂质过氧化以及相关蛋白、细胞结构的破坏、组织损伤或基因突变。这些氧化应激损伤被认为是多种心血管、老年性和免疫性等疾病的重要致病因素［1］。在肿瘤的起始（initiation）、促进（promotion）和演变（progression）三个阶段中，氧化应激同样具有非常重要的作用。在起始阶段，氧化应激引起DNA损伤，转录和复制错误，遗传基因变异，从而使正常细胞癌变。在促进阶段，活性氧（ROS）通过ERK/MEK和PI3K/AKT等通路激活NF-κB、Nrf2、HIF、p53等核转录因子，导致肿瘤细胞增殖和免于凋亡。在演变阶段，ROS促进血管生成，上调金属蛋白酶 （MMP），从而参与肿瘤的转移［2］。

清肺合剂 （原名中肺合剂）是我院 （浙江省肿瘤医院）几代中医药工作者经过多年的临床实践研制、归纳、提炼出来的经验方制成的医院制剂，具有清热化痰解毒、软坚散结和活血之功效，目前主要用于晚期肺癌的治疗，早、中期肺癌的辅助治疗以及肺癌、肺炎、放射性肺炎引起的咳嗽多痰、胸痛、咳血等症的治疗。在我院已有40年（1973年开始研制）的应用历史，并深受临床医生和病人的认可［3-7］。

为了更多的明确该制剂的作用机制，本研究通过测定清除自由基和抗氧化能力，从抗氧化防御角度探讨了清肺合剂的抗肿瘤作用，为其临床应用提供科学依据。

1 试剂与材料

1.1 清肺合剂 浙药制字Z20100019，由浙江省肿瘤医院中药制剂室提供。处方组成：浙贝母41 g、白花蛇舌草110 g、龙葵110 g、重楼36 g、半枝莲110 g、白茅根110 g、仙鹤草55 g、夏枯草55 g、防己41 g、天龙3 g。制法：以上十味，加水煎煮二次，第一次2 h，第二次1.5 h，合并煎液，放置使沉淀，取上清液，加入苯甲酸钠3 g和冰糖178 g，混匀，放置使沉淀，取上清液，滤过，浓缩至1 000 mL，分装、灭菌，即得。质量浓度以投入生药计算，成品质量浓度为671 mg/mL。临实验前，样品以生理盐水稀释至供试浓度。

1.2 试剂 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）和菲咯嗪（ferrozine）购自美国Sigma Aldrich公司。维生素E（Vit-E）和维生素C（Vit-C）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。总抗氧化能力 （T-AOC）检测试剂盒，超氧阴离子自由基，羟基自由基和丙二醛 （MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其它试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 DPPH自由基清除能力的测定 DPPH自由基清除能力测定根据Yokozawa等人描述的方法略做改进［8-9］。在96孔板中加入100μL 0.5 mmol/L新配制的DPPH自由基无水乙醇溶液，再加入100μL不同梯度质量浓度的清肺合剂稀

释液，设置空白对照和阳性对照，空白对照加入100μL生理盐水，阳性对照加入100μL质量浓度为25μg/mL的维生素C溶液，各复3孔。摇匀后避光室温反应30 min，酶标仪517 nm测吸光度，吸光度值越低表示自由基清除能力越强。

2.2 羟自由基清除能力的测定 根据羟基自由基检测试剂盒说明，采用Fenton反应产生羟基自由基，用Griess试剂显色。设置空白对照和维生素C阳性对照，各浓度样品复3管。

2.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定 根据超氧阴离子自由基检测试剂盒说明，采用黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基，用Griess试剂显色。设置空白对照和维生素C阳性对照，各浓度样品复3管。

2.4 总抗氧化能力（T-AOC）的测定 按总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒说明，以FRAP法（Fe3+还原成Fe2+的能力测定法）测定。设置空白对照和维生素C阳性对照，各浓度样品复3管。

2.5 抗脂质过氧化测定［9］在大鼠肝匀浆组织中以Fe2+-维生素C诱导产生脂质过氧化反应，以硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛 （MDA）的量来反映脂质过氧化的水平。取供试品200μL，先加入10%的大鼠肝匀浆400 μL，后加800μmol/L的维生素C和200μmol/L FeCl2溶液各100μL，振荡均匀后37℃反应1.5 h。取反应后的匀浆100μL，按MDA测定试剂盒说明操作。以维生素E为阳性对照，各剂量样品复3管，计算抑制率。

2.6 亚铁离子络合能力［9］采用菲咯嗪试剂测定，Fe2+与菲咯嗪试剂能形成红色络合物，在562 nm处有最大吸收。96孔板中，加供试品100μL和0.25 mmol/L的FeCl2溶液50μL，设置空白对照和EDTA阳性对照，常温反应10 min后，加1 mmol/L的菲咯嗪50μL，562 nm测吸光度。各浓度样品复3孔，计算抑制率。

2.7 统计分析 所得数据用平均值±标准差表示，并用t检验法和one-way ANOVA方差分析比较各组间的统计学差异，P＜0.05认为在统计学上有显著性。

3 实验结果

3.1 清肺合剂对DPPH自由基的清除作用 DPPH是一种以氮为中心的自由基，无论是给出电子或者得到氢被还原时溶液颜色会由紫色变为黄色。作为一种稳定的自由基，本实验首先采用DPPH自由基研究清肺合剂的自由基清除能力，结果见图1。清肺合剂稀释5 120倍 （0.13 mg/mL）后还有近5%的清除能力，5 120～160倍稀释液 （0.13～4.19 mg/mL）能剂量依赖性地清除DPPH自由基，且呈较好的线性关系 （r=0.985）。

3.2 清肺合剂对羟基自由基的清除作用 在所有的含氧自由基中，羟基自由基是生物体系内最活泼的自由基，其在自由基病理学中被公认为是最具有破坏力的自由基，几乎可以破坏活细胞内的一切分子。如同对DPPH自由基一样，清肺合剂2 560～160倍稀释液（0.26～4.19mg/mL）能剂量依赖性地清除羟基自由基 （图2）。

图1 清肺合剂对DPPH自由基的清除作用

图2 清肺合剂对羟基自由基的清除作用

3.3 清肺合剂对超氧阴离子自由基的清除作用 超氧阴离子自由基是较弱的自由基，但它在强而有危害的活性氧如过氧化氢、羟基自由基和单线态氧的形成过程中起着非常重要的作用。相比对羟基自由基极强的清除能力，清肺合剂对超氧阴离子自由基的清除能力相对较弱，但在稀释640倍 （1.05mg/mL）以上的质量浓度也能剂量依赖性地显著抑制超氧阴离子自由基的产生 （图3）。

图3 清肺合剂对超氧阴离子自由基的清除作用

3.4 清肺合剂的总抗氧化能力（T-AOC） 清肺合剂的总抗氧化能力结果如图4所示，清肺合剂稀释2 560倍（0.26mg/mL）以上质量浓度表现出剂量依赖性的提高总抗氧化能力的作用。

3.5 清肺合剂对脂质过氧化的抑制作用 脂质过氧化是引起各种病理结果的直接因素。清肺合剂2 560～160倍稀释液（0.26～4.19 mg/mL）能剂量依赖性地抑制大鼠肝匀浆中Fe2+-维生素C诱导的脂质过氧化反应 （图5）。

图4 清肺合剂的总抗氧化能力

图5 清肺合剂对脂质过氧化的抑制作用

3.6 清肺合剂的亚铁离子络合能力 金属络合能力因可以减少脂质过氧化中催化金属的浓度而产生重要的抗氧化作用。Fe2+是各种催化金属离子中最强的助氧化剂，因此本实验评价了清肺合剂与菲咯嗪竞争络合Fe2+的能力，结果见图6。清肺合剂 5 120～20倍稀释液 （0.13～33.55 mg/mL）能剂量依赖性地络合Fe2+。

图6 清肺合剂的亚铁离子络合能力

4 讨论

肺癌的发病率和死亡率居世界首位，其病因病理复杂。由于肺在生理结构上是最易受内外环境ROS影响的组织器官，因此，较其他组织器官，ROS的氧化应激在肺癌的发病过程中具有更重要的作用。如据流行病学调查：长期吸烟会诱导气管炎症，白细胞堆积和激活，产生大量的ROS，损伤细胞膜，引起蛋白质和DNA突变，大大增加患肺癌的概率。其他致肺癌的环境因素如石棉、多环芳香族化合物等同样通过ROS氧化应激引起细胞DNA的断裂、序列错位、拷贝数改变或甲基化等。ROS参与肿瘤发病的机制被认为与细胞色素-P、谷光苷肽S-转移酶、组蛋白脱乙酰酶、N-乙酰转移酶等分子反应，引起EGFR、RAS、p53等通路的改变有关［10］。

清肺合剂以软坚散结、止咳化痰止痛为原则，用重楼、浙贝母、白花蛇舌草、半枝莲、龙葵等清热解毒、消肿止痛以抗癌；仙鹤草收敛止血、解毒抗癌并治素体虚损而固本；白茅根凉血止血并治热病烦渴。综合全方，配伍严谨，群药相伍，共奏清热解毒、开郁化痰、止咳平喘、祛瘀散结、固本止痛之效。多年的临床观察表明，清肺合剂在肺癌和肺炎的治疗中，对改善患者的临床症状，提高患者的生活质量，减轻化疗的毒副反应等方面具有临床意义［3-7］。前期实验研究表明清肺合剂抗肿瘤的机制主要有：①抑制鼠肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡；②通过降低肿瘤组织基质金属蛋白酶（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达和降低肿瘤组织微血管密度 （MVD）而抑制肿瘤新生血管的生成［11-13］。

本研究对其抗肿瘤的机制从抗氧化应激角度进一步做了探讨，结果显示清肺合剂具有较好的清除自由基和抗氧化能力。该复方制剂由于组分复杂，尚未能阐明其作用的物质基础。但有研究认为，大多数植物提取物的清除自由基和抗氧化能力与其含有的酚酸类和黄酮类物质有关［14-15］。HPLC和薄层色谱测定发现清肺合剂中除含1 mg/L以上的防己诺林碱和粉防己碱外［16］，还含有绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、迷迭香酸和齐墩果酸等酚酸类物质及黄酮类物质野黄芩苷［17-18］。这类物质可作为电子供体阻断自由基链反应，从而发挥清除自由基和抗氧化能力。

综上所述，清肺合剂的抗氧化应激能力可能是其临床治疗肺癌的机制之一。由于清肺合剂中成分多种复杂，其活性的主要成分有待进一步研究。由于氧化应激参与肺癌的起始、促进和演变各阶段，分子调控网络复杂，因此，清肺合剂调控ROS抗肺癌的分子机制也需要作深入研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2527-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.044

2014-05-16

浙江省中医药科技计划 （2012ZA021）

周俐斐（1984—），女，硕士生，主管中药师，从事中药药理学研究。E-mail：feifei1984_zhou@126.com

*通信作者：何俏军 （1970—），男，教授，博士生导师，从事抗肿瘤药理学研究。Tel：（0571）88208400，E-mail：qiaojunhe@zju. edu.cn