香参丸对结肠炎大鼠小肠派伊尔结中T细胞亚群及IL-2、TGF-β表达的调节

刘端勇， 徐 荣， 黄敏芳， 王 馨， 邹 勇， 岳海洋， 赵海梅

（1.江西中医药大学科技学院，江西南昌330025；2.江西中医药大学研究生院，江西南昌330004；3.江西中医药大学基础医学院方剂教研室，江西南昌330004）

香参丸对结肠炎大鼠小肠派伊尔结中T细胞亚群及IL-2、TGF-β表达的调节

刘端勇1， 徐 荣2， 黄敏芳2， 王 馨2， 邹 勇2， 岳海洋2， 赵海梅3*

（1.江西中医药大学科技学院，江西南昌330025；2.江西中医药大学研究生院，江西南昌330004；3.江西中医药大学基础医学院方剂教研室，江西南昌330004）

目的 评价香参丸治疗实验性结肠炎疗效并探讨其作用机制。方法 三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）/乙醇法复制实验性结肠炎，实验动物随机分成正常组、模型组、香参丸组及美沙拉嗪组，造模后灌胃给药7 d，第8天处理，通过肠重指数、结肠长度、肉眼损伤评分评价其疗效，同时分别采用流式细胞术和酶联免疫吸附法检测大鼠小肠派伊尔结（PP结）中CD4+T、CD8+T淋巴细胞水平以及结肠组织白细胞介素-2（IL-2）、转化生长因子-β（TGF-β）的量。结果 与模型组比较，香参丸组可明显缩短结肠长度，降低结肠指数、肉眼下损伤评分、小肠PP结中CD4+T淋巴细胞水平以及结肠组织中IL-2和TGF-β表达水平（P＜0.05或P＜0.01），升高小肠PP结中CD8+T细胞水平，且同时降低CD4/CD8间比例。结论 香参丸有效治疗溃疡性结肠炎的机制可能是通过调节小肠PP结中T淋巴细胞亚群平衡，抑制IL-2和TGF-β表达水平来实现的。

香参丸；结肠炎；T细胞；IL-2；TGF-β

香参丸由苦参、木香组成，出自清代名医叶天士，其中苦参苦寒，功长清热燥湿，主要用于治疗肠风便血，对热痢、血痢疗效较好［1］，多与木香同用，木香辛开苦降，善行大肠之气滞，为治疗湿热泻痢之要药，二者相配，协同起效，加甘草解毒并缓中健脾，现代常用于治疗包括溃疡性结肠炎在内的各种泻痢，但其作用机制不明。炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克隆病，目前普遍认为IBD的产生主要来自于黏膜免疫、相关基因和环境因素，而效应T细胞的活化是肠黏膜免疫及其后续炎症的起点［2-3］。作为肠黏膜免疫系统的重要组织，小肠派伊尔结 （Peyer patch，PP结）主要由T淋巴细胞（以CD4+T淋巴细胞为主）和B淋巴细胞组成，这些细胞在抗原刺激及抗原提呈细胞的作用下活化，并高度表达相应的受体，与对应的配体结合后进入黏膜组织，释放出炎性因子，介导炎性损伤［4］。为此，本研究采用TNBS/乙醇法复制实验性结肠炎，并用香参丸干预治疗，在观察其疗效同时并探讨其对PP结中T淋巴细胞亚群平衡的影响。

1 实验材料

1.1 动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠40只，体质量200～220 g（由北京维通利华实验动物有限公司提供），合格证号SCXK（京）2012-0001，随机分为4组，即正常组、对照组、香参丸组、美沙拉嗪对照组 （阳性对照组），每组10只，适应性饲养3 d后用于实验。

1.2 主要药物和试剂 香参丸由苦参 （批号1306056）、广木香 （批号1308261）、甘草 （批号1308211）组成，中药配方颗粒购自广东一方制药有限公司；美沙拉嗪肠溶片每片0.25 g（葵花药业生产，批号130407）；TNBS（2，4，6-Trinitrobenzene sulfonic acid solution）分子量为293.17，购于美国SIGMA公司（批号2508-19-2）；FITC-anti-rat CD4+Ab（批号11-0040-82）、APC-anti-rat CD3+Ab（批号17-0030-82）、PE-anti-rat CD8+Ab（批号12-0084-82）购于美国eBioscience公司；IL-2（批号85-BMS634）和TGF-β（批号85-BMS623/3）酶联免疫吸附试验试剂盒亦购于美国eBioscience公司。

1.3 主要仪器 酶标仪（Molecular Devices SpectraMax Plus 384）；低温高速离心机（eppendorf Centrifuge 5430R）；流式细胞仪（美国BD FACSC CantoⅡ）

2 实验方法

2.1 造模 参考文献［5］，采用TNBS复制溃疡性结肠炎

大鼠模型。造模前禁食12 h，除正常组外，所有大鼠用10%的水合氯醛（0.4 g/kg）麻醉［6］后，按100 mg/kg TNBS计算，将TNBS溶入0.3 mL 50%乙醇配制TNBS乙醇复合溶液，用塑料软管 （直径约为2mm）将TNBS乙醇复合液注入距肛门约8 cm处，倒置大鼠15min，使药液到达结肠，然后动物放回原笼自然苏醒，正常组注入等容积的50%的乙醇溶液，即造模成功。

2.2 给药 造模24 h后，开始给大鼠灌胃给药，按体质量换算，香参丸组给予香参丸2.5 g/kg，美沙拉嗪组给予美沙拉嗪0.3 g/kg，空白组及模型组则给予等容积的生理盐水，每日给药1次，连续给药7 d。

2.3 处理方法 给药7 d后，脱颈椎处死动物，分离距肛门2 cm以上结肠组织，测量其长度，沿纵轴剪开结肠，清除内容物，清洗干净并吸去水分，称取结肠质量，将结肠于冰块上展开，并将肠黏膜向上平铺于冰块上固定，观察炎症及溃疡发生情况，按照肉眼观察结肠黏膜损伤评分标准［7-8］进行结肠损伤评分。同时计算各组老鼠结肠指数，结肠指数=（结肠质量/体质量）×100%，以考察结肠水肿等炎症表现。

2.4 PP结分离及细胞悬液制备 给药7 d后，脱椎处死动物后，剖腹剪取全小肠，分离PP结，置于5%FCS RPMI 1640培养液中，300目不绣钢网碾磨滤过，洗涤2次，3 000 r/min离心，5 min后，弃其上清，混匀定容于1×106后置4℃冰箱保存。

2.5 流式细胞术测CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞水平取上述细胞悬液，分别加入0.5uL PE-anti-rat CD8+Ab，FITC-anti-rat CD4+Ab，APC-anti-rat CD3+Ab等荧光标记抗体，室温下避光孵育30min后，加入1mLPBS洗涤，离心后弃上清，1%多聚甲醛的PBS固定后置4℃冰箱保存，待上机检测。

2.6 酶联免疫吸附法检测结肠局部细胞因子水平 参照试剂盒的说明书检测结肠组织匀浆中IL-2、TGF-β的量。待测上清液、标准品使用量均为50μL，波长450 nm下测定吸光度值。

2.7 统计学方法 采用SPSS 16.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，病理组织记分采用秩和检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 病理学观察及结肠损伤评分 肉眼下可见模型组结肠黏膜明显充血、水肿，重度糜烂和多个溃疡，溃疡呈圆形或椭圆形，底部干净，或可见少量淡黄色覆盖物，边缘充血水肿；肠重指数、结肠损伤评分明显高于正常组，结肠长度明显缩短 （P＜0.01）；治疗组亦可见少量充血水肿和部分结肠可见轻度糜烂和溃疡，溃疡数目明显减少并且充血水肿减轻，与模型组比较结肠指数、肉眼下结肠损伤评分明显下降、结肠肿胀程度明显减轻，结肠长度显著延长（P＜0.01或P＜0.05）。提示香参丸治疗组可明显缓解结肠损伤局部充血水肿，减轻炎细胞浸润程度，抑制溃疡形成。结果见表1。

3.2 结肠组织中IL-2、TGF-β的表达 由表1可见，模型组大鼠结肠组织IL-2、TGF-β表达水平明显高于正常组（P＜0.05）；治疗组与模型组比较，IL-2和TGF-β表达水平下降，且具有显著性差异 （P＜0.05或P＜0.01）。

表1 疗效评价及IL-2、TGF-β细胞因子的表达

表1 疗效评价及IL-2、TGF-β细胞因子的表达

注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

分组 肠重指数/% 结肠长度/cm 肉眼下结肠损伤评分 IL-2/（pg.mL-1） TGF-β/（pg.m L-1）0.52±0.03 19.71±1.99 0.3±0.48 0.39±0.17 0.35±0.06模型组 1.02±0.43# 16.19±1.41## 5.89±2.81## 0.58±0.13# 0.45±0.03#香参丸组 0.65±0.08* 17.87±1.46* 2.22±1.39** 0.38±0.08** 0.39±0.05*美沙拉嗪组 0.71±0.12* 16.38±1.31 3.33±2.12* 0.35±0.11** 0.38±0.07正常组*

3.3 流式细胞术测定小肠PP结中CD4+、CD8+T淋巴细胞水平 与正常组比较可见，模型组CD4+T淋巴细胞水平显著升高，CD8+T淋巴细胞水平显著降低 （P＜0.05），CD4/CD8T的比值则显著升高 （P＜0.01）；与模型组比较，各治疗组CD4+T淋巴细胞水平均显著下降，而CD8+T淋巴细胞水平则显著增加（P＜0.05），因此CD4/CD8T淋巴细胞的比值则明显降低（P＜0.01或P＜0.05），结果见表2。

表2 大鼠小肠PP结中CD4+、CD8+T淋巴细胞比较

表2 大鼠小肠PP结中CD4+、CD8+T淋巴细胞比较

注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

CD4T/CD8正常组分组 CD4+T/% CD8+T/% 34.06±13.99 65.76±16.91 0.52±0.49模型组 57.60±16.56# 35.78±13.41# 1.61±0.56##香参丸组 32.73±1.62* 60.46±12.26* 0.54±0.43**美沙拉嗪组 37.97±14.01 63.35±17.51* 0.60±0.41**

4 讨论

在本实验中，模型组大鼠肠重指数以及肉眼下的结肠损伤评分均较正常组明显升高，结肠长度明显缩短，而采用香参丸灌胃治疗后肠重指数及损伤评分均明显降低，而结肠长度显著延长，说明香参丸能有效缓解实验性结肠炎的炎症损伤程度和溃疡形成。

肠黏膜免疫功能紊乱与UC发病密切相关，来自PP结的T淋巴细胞进入肠粘膜固有层失衡并活化，发挥效应作用，因此观察其T淋巴细胞平衡是监控黏膜免疫状态的重要手段［5］。本实验结果表明，香参丸可明显降低结肠炎大鼠小肠PP结中CD4+T淋巴细胞水平，升高CD8+T淋巴细胞水平，同时下调CD4/CD8比值，其原因可能是某些方面结肠局部致病性T淋巴细胞增多，免疫功能紊乱，且在此实验中，炎性因子IL-2和TGF-β分泌增多，IL-2作为重要的促炎细胞因子，要由活化的Th1细胞或CD4+T细胞分

泌，与单核巨噬细胞、B细胞及T细胞表面的IL-2受体结合后，能够诱导自然杀伤 （NK）细胞生成并增强其活性；引起T细胞增殖、活化；促进细胞毒T细胞的杀伤作用［7-9］。因此，IL-2对于自身免疫调节具有重要意义。TGF-β是一种有效的免疫抑制因子，TGF-β水平的下降，将有利于淋巴细胞的激活，这将促进自身抗体和自身致敏T细胞的产生，诱导自身免疫反应，导致炎性免疫损伤［10-12］。TGF-β主要在结肠黏膜固有层的炎细胞如中性粒细胞、淋巴细胞及浆细胞中表达，TGF-β在正常结肠粘膜中的表达很弱，而在UC中表达明显增强［13-14］。本研究表明模型组大鼠结肠组织中IL-2和TGF-β的水平均明显升高，经过香参丸治疗后，结肠炎大鼠结肠组织中IL-2和TGF-β表达下降。此表明香参丸治疗UC的机制之一可能是通过调节肠黏膜局部T淋巴细胞亚群平衡，抑制促炎因子IL-2和TGF-β的表达，从而抑制异常免疫反应，减轻免疫损伤，促进溃疡愈合。

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2524-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.043

2014-11-10

国家自然科学基金项目 （81460679，81260595）；江西省自然科学基金项目 （20122BAB215046）

刘端勇 （1975—），男，博士，副教授，从事溃疡性结肠炎与中药免疫药理研究。Tel：（0791）86588407，E-mail：liuduanyong@163.com

*通信作者：赵海梅 （1979—），女，博士，副教授，研究方向为溃疡性结肠炎与中药免疫药理。Tel： （0791）86588407，E-mail：haimei79@163.com