综合权重相关分析优选鸡血藤抗肝肿瘤组分的提取工艺

潘 虹， 包永睿， 孟宪生*， 王 帅

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁大连116600）

综合权重相关分析优选鸡血藤抗肝肿瘤组分的提取工艺

潘 虹1，2，3， 包永睿1，2，3， 孟宪生1，2，3*， 王 帅1，2，3

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁大连116600）

目的 优选鸡血藤抗肝肿瘤有效组分的提取工艺，为其生产利用提供可靠依据。方法 采用正交设计试验方法，选取提取时间、料液比、提取次数、乙醇体积分数为考察因素，以药效为指标，优选提取工艺，再测定总黄酮含有量、芒柄花素含有量和出膏率。然后，通过对这三项指标赋予不同权重所得的多组综合评分与药效指标 （细胞抑制率）进行相关度分析，确定能反映药效的指标及其权重范围。结果 鸡血藤有效组分的最佳提取工艺为50%乙醇加热回流提取2次，料液比1：30，提取时间1.5 h。总黄酮和芒柄花素含有量的最佳权重系数范围分别为0.6～1和0～0.4。结论 该工艺条件下，细胞抑制率、总黄酮提取率及芒柄花素含有量均比较高，表明该方法合理、提取工艺稳定可行。

鸡血藤；抗肝肿瘤；提取工艺；正交设计；总黄酮；芒柄花素

鸡血藤为豆科植物密花豆Spatholobus Suberectus的干燥藤茎，是一味沿用千年的活血化瘀中药，古代多篇本草论著中都记载了其 “去瘀血，生新血”的功效，并称之为 “血分之圣药”［1］，其又名血风、血藤、大血藤、血风藤、三叶鸡血藤、九层风、红藤、活血藤，功效补血、活血、通络，用于治疗月经不调、血虚萎黄、麻木瘫痪、风湿痹痛。现代临床研究表明，鸡血藤具有改善血流量、调节免疫、抗炎、抗肿瘤、抗病毒的功效［2］，其抗肿瘤的有效成分为黄酮、缩合鞣质类化合物［3-4］，也是鸡血藤的主要活性物质。目前，有关该植物主要活性组分的最佳提取工艺往往仅以一项指标的含有量为标准，并不能完全反映其药理药效，存在片面性。本实验采用以细胞抑制率为主要指标的正交试验［5-6］，对总黄酮含有量、出膏率、芒柄花素含有量这三项指标赋予权重系数，得到多组综合评分，再利用Pearson相关系数法分析综合评分与抑制率的相关程度，从而分别对三者制定出一个合理的权重系数范围，避免了人为规定权重系数的主观性，可为其他药材提取工艺的优选提供参考。

1 实验材料

1.1 药材与试剂 鸡血藤 （产地河北，阳光大药房）。芒柄花素、芦丁对照品 （中国食品药品检定研 究 院， 批 号 分 别 为 110704-200420、100080200707）。乙腈为色谱纯 （美国 Tedia公司）；亚硝酸钠为分析纯 （苏州天申化学有限公司）；氢氧化钠、无水乙醇均为分析纯 （天津市科密欧化学试剂有限公司）；硝酸铝为分析纯 （天津凯信化学工业有限公司）；水为去离子水 （自制）。

1.2 仪器 Agilent1100 HPLC色谱仪，包括DAD检测器、自动进样器（美国Agilent Technologies公司）；UV-1750紫外可见分光光度计 （日本岛津公司）；MiLLi-Q超纯水处理装置（美国Millipore公司）；Sunrise酶标仪（奥地利Tecan公司）；UAIRETM US Autoflow CO2培养箱（德国Nuaire公司）。

1.3 实验瘤株 人肝癌细胞株SMMC-7721（上海复蒙基因生物科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 鸡血藤的药效学实验

2.1.1 细胞培养 人肝癌细胞株SMMC-7721常规培养于10%热灭活小牛血清的1640培养液 （含青链霉素100 U/mL）中，37℃、5%CO2培养箱中连续培养。

2.1.2 含药培养液的制备 取鸡血藤提取液干膏粉末10 mg，溶于5 mL培养液中，加入2‰DMSO助溶，0.22μm微孔滤膜滤过，备用。

2.1.3 MTT试验 取处于对数生长期的SMMC-7721细胞进行计数，调整细胞密度为5×104个/ m L，接种于96孔培养板中，每孔加入细胞悬液100μL，于37℃、5%CO2饱和湿度下培养24 h，每个正交试验组设5个复孔，每孔加入MTT（5 mg/mL）20μL，继续培养4 h。然后，加入DMSO 150μL，孵育10 min后溶解，酶标免疫测定仪测定490 nm处的吸光度 （A）值，计算细胞增殖抑制率［7-9］，公式为增殖抑制率=［（对照组A值-加药组A值）/对照组A值］×100%

2.2 总黄酮的测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10.00 mg，置于50 m L量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 检测波长的选择 称取对照品适量，加70%乙醇溶解，倒入比色皿中，于300～800 nm处进行全波长扫描，最终确定鸡血藤总黄酮的最大波长为510 nm。

2.2.3 标准曲线的绘制 精密吸取芦丁对照品溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分别置于6个25 mL量瓶中，加入5%亚硝酸钠 （现配）1 mL，静置6 min，再加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液10 m L，加水至刻度，摇匀，静置15 min。然后，以不加芦丁的空白试液为参比，于510 nm处测定吸光度［10-11］，以芦丁的质量浓度 （mg/mL）为横坐标 （X），吸光度为纵坐标 （Y），绘制标准曲线，

得到回归方程Y=13.190X-0.009 0，r=0.999 7，表明芦丁在0.4～1.4 mg范围内线性关系良好。

2.3 芒柄花素的测定

2.3.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流动相为2‰甲酸水溶液（A）-乙腈 （B），等度洗脱 （0～30 min，66%A→34%B）；体积流量1 mL/min；柱温25℃；检测波长254 nm；进样量10μL［12］。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密吸取芒柄花素对照品5.00 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，即得质量浓度为0.5 mg/m L的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取鸡血藤提取液干膏粉末0.3 g，置于10 m L量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

3 正交试验

3.1 从抑制率为主指标的正交试验结果 选取提取时间、乙醇用量、提取次数为考察因素，以细胞抑制率为主要指标，优选提取工艺，结果见表1和表2，可知各因素对提取工艺影响的顺序为C＞A＞B＞D。然后，以极值最小的D因素为误差项进行方差分析，发现A、C具有显著性影响，通过极差值 （R）大小判定主次因素，通过试验指标平均值 （K）大小判定最优水平及组合，最终确定最佳提取工艺为A2B2C2D1，即加入30倍量50%乙醇，回流提取2次，每次1.5 h。

表1 抑制率的直观分析Tab.1 Intuitive anaIysis of inhibition rates

3.2 正交试验抑制率与综合评估、相关系数结果以总黄酮含有量、芒柄花素含有量、出膏率为指标，考察因素与抑制率一致，以0.2为间距赋予权重系数，得到一系列综合评分。然后，以抑制率为核心，利用Pearson相关系数分析对每项指标及每组综合评分与抑制率的相关度进行分析评价，结果见表3～5。由表可知，当总黄酮含有量和出膏率这两项指标被赋予的权重系数越大时，综合评分与药效指标的相关度就越高。总黄酮含有量与细胞抑制率的相关系数达92.07%，表明其为抗肝肿瘤的主要药效成分；总黄酮含有量与出膏率的相关系数达96.96%，表明出膏率越高，黄酮含有量越大，同时抑制肝癌细胞生长的能力越强，表明它也是反映药效的主要指标；芒柄花素含有量与细胞抑制率的相关系数仅为66.54%，表明单以芒柄花素含有量作为优选提取工艺的指标性成分是不合理的。但也有文献报道将其作为鸡血藤有效活性部位的指标性成分［13-14］，故须赋予合理的权重系数方可作为指标。另外，芒柄花素作为提取工艺指标的权重系数范围为0～0.4，对于总黄酮含有量和出膏率而言，两者几乎可以互相替代，若将两者均作为指标来考察，则其加和范围为0.6～1，而若只以其中一个作为指标，则可控制在0.6～1之间。

表2 抑制率的方差分析Tab.2 Variance anaIysis of inhibition rates

4 验证试验

为了保证提取工艺的药效，避免操作的复杂性，本实验基于利用药效筛选出来的最佳工艺，平行测定鸡血藤药材粉末4份，每份5 g。将总黄酮含有量与出膏率分别在权重范围内选择4组权重系数，利用综合评分与药效的相关性，对权重范围的准确性及最佳提取工艺的稳定性进行验证，试验结果见表6～7。由表可知，总黄酮与芒柄花素含有量被赋予的权重系数在权重范围内，其结果与药效的相关度较高，达到90%以上，但在权重范围之外时，相关度则较低，只有75%左右。因此，权重系数范围的选择是合理的，表明总黄酮与芒柄花素含有量的权重系数在合理范围内，可代替药效来优选鸡血藤有效组分提取工艺。在本实验条件下，鸡血藤的最佳提取工艺稳定可行，而且药效学结果稳定。

表3 正交试验抑制率与综合评分、相关系数 （1）Tab.3 Com posite scores and the correIation coefficien ts of inhibition rates by orthogonaIexperiments（1）

表4 正交试验抑制率与综合评分、相关系数结果 （2）Tab.4 Com posite scores and the correIation coefficients of inhibition rates by orthogonaIexperiments（2）

表5 正交试验抑制率与综合评分、相关系数结果 （3）Tab.5 Com posite scores and the correIation coefficien ts of inhibition rates by orthogonaIexperiments（3）

表6 总黄酮与芒柄花素含有量的权重比例Tab.6 W eight ratios of the contents of totaI fIavonoidsand formononetin

表7 抑制率与权重范围内、外两组综合评分的相关度分析Tab.7 CorreIation ana Iysis of the inhibition rates and com posite scores of inside groups and outside groups in the weight range

5 讨论

本实验首先通过正交试验考察，以细胞抑制率为指标，优选鸡血藤有效组分的提取工艺。然后，规律性地赋予各项指标以0.2递增的权重系数，同时引入Pearson相关性分析方法，能更好地说明两变量在一定研究范围内的密切程度。正交试验综合评分可探讨药效与化学成分的相关性，确定了能反映药效的最佳指标为总黄酮和芒柄花素含有量，并计算出每项指标合理的权重范围。最后，建立以总黄酮含有量为主要指标，芒柄花素含有量为次要指标，结果与以药效为主指标时较为一致，表明权重范围的建立是合理的。

通过相关性试验发现，总黄酮含有量与出膏率这两项指标可互相取代。为了简化试验流程，本实验只选取了总黄酮与芒柄花素含有量作为指标进行验证，显示出膏率在转移称量过程中误差较大。因此，若有更精准的称量环境，亦可采用出膏率与芒柄花素含有量为指标，优选鸡血藤抗肝肿瘤有效组分的提取工艺。

鸡血藤化学成分复杂，其提取工艺的研究要以药效为主要指标才有意义。目前，许多相关报道常以单一成分作为衡量鸡血藤有效组分提取工艺的标准，并不能完全与药效有直接的线性关系，而若以药效为主要指标考察，则操作耗时复杂，一些单位并不具备进行药效实验的条件。因此，为了避免这类情况发生，简化提取工艺，并确保有效组分被充分提取利用，综合权重相关分析法不仅弥补了传统提取工艺的不足，找出可替代药效并便于测定含有量的其他指标，而且稳定可行，为鸡血藤药材抗肝肿瘤有效组分提取工艺的优选提供了可靠、清晰的应用依据。

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Optim ization of the extraction process of constituents in Spatholobi Caulis in treating Iiver tum orsw ith themethod of com prehensive weighted and correIation anaIysis

PAN Hong1，2，3， BAO Yong-rui1，2，3*， MENG Xian-sheng1，2，3*， WANG Shuai1，2，3

（1.Liaoning University of TraditionalGhinese Medicine，Dalian 116600，Ghina；2.Liaoning Provincial Engineering Research Genter ofGhinese Medicine Ingredients，Dalian 116600，Ghina；3.Liaoning Modern Traditional Ghinese Medicine Research and Engineering Laboratory，Dalian 116600，Ghina）

Spatholobi Gaulis；treating liver tumor；extraction process；orthogonal design；total flavonids；formononetin

R284.2

A

1001-1528（2015）11-2413-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.016

2014-08-05

“十二五”重大新药创制科技重大专项 （2013ZX09507005）

潘 虹 （1989—），女，硕士，研究方向为药物分析。Tel：18842654080，E-mail：15840856279@163.com

*通信作者：孟宪生 （1964—），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药组分配伍、代谢组学及药品质量分析。Tel：（0411）85890185