多成分综合评分法优化高良姜乙醇提取工艺研究

程守前， 李永辉， 陈 峰， 魏 娜， 王 勇， 谭银丰， 李海龙， 张小坡，张俊清*， 李友宾，*

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.海南医学院 海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南海口571199）

多成分综合评分法优化高良姜乙醇提取工艺研究

程守前1， 李永辉2， 陈 峰2， 魏 娜2， 王 勇2， 谭银丰2， 李海龙2， 张小坡2，张俊清2*， 李友宾1，2*

（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.海南医学院 海南省热带药用植物研究开发重点实验室，海南海口571199）

目的 优化高良姜的乙醇提取工艺。方法 建立高效液相色谱法，同时测定高良姜中5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮、高良姜素、山柰素、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮和1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮5种成分，采用L9（34）正交试验法，以上述5种成分含有量的综合评分为指标，考察乙醇体积分数、提取时间、提取次数和料液比4个影响因素，优选高良姜的醇提工艺。结果 提取次数对高良姜的提取工艺有显著性影响，优选出的提取工艺为加10倍量80%乙醇，提取3次，每次1 h；高良姜中5种成分的转移率分别为5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮91.7%、高良姜素92.3%、山柰素85.0%、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮94.8%、1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮93.9%。结论 多成分综合评分法优选出的提取工艺能对高良姜药材进行较完全地提取，可用于在线监控。

高良姜；正交设计；综合评分法；提取工艺

中药是多种复杂化学成分的载体，其药效是多种活性成分综合作用的结果。中药药效的发挥与提取工艺有很大的关系，《炮炙大法》指出 “凡服汤药，虽品物专精，修治如法，而煎药者鲁莽造次，水火不良，火候失度，则药亦无功”。可见在中药规范的煎煮过程中，要考虑煎药的容器、用水量、火候、煎煮次数和一些特殊的煎煮方法，如先煎、后下、冲服等。因此，在现代中药提取工艺中，需要最大程度地提取活性成分，提高转移率，在保证充分发挥药效的同时又可避免有限的中药资源的浪费。

高良姜为姜科山姜属植物高良姜Alpinia officinarum Hance的干燥根茎，其性热味辛，归脾、胃经，有温胃、祛风、散寒、行气、消食、止痛的功效［1］。现代药理学研究表明高良姜具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗胃肠道出血、抗胃溃疡和保护胃黏膜等多种药理作用，这些功效主要由黄酮类、二苯基庚烷类等多种活性成分体现［2-3］。以往对于高良姜提取工艺的考察主要采用紫外分光光度法以总黄酮为考察指标［4］，或以单一高良姜素为指标考察提取工艺［5］，而以多成分综合评分为指标，采用HPLC法考察高良姜的乙醇提取工艺未见报道，多成分综合评分法优化高良姜提取工艺充分考虑了多种活性成分的溶出度，这样的提取物才能充分体现高良姜的药效功能，对其他中药材的提取工艺具有一定的指导意义。

黄酮类和二苯基庚烷类化合物是高良姜的主要成分，其中高良姜素和山柰素是主要的黄酮类成分［6］；5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮和1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮是主要的二苯基庚烷类成分，这5种成分在药材中含有量较高，是不同产地高良姜中的共有成分［7］，因此本实验以这5种主要成分为考察指标，采用综合评分法研究高良姜的提取工艺，使得高良姜提取工艺更加科学合理，为高良姜的提取及工业化生产提供实验依据。

1 仪器与药品

Waters2695-2996高效液相色谱仪，Empower工作站；XS-Dualrange分析天平（Mettler-Toledo）；Casada超纯水系统（Pall corporation）；Dst-50L多功能动态提取浓缩机组 （上海砥实机械有限公司）；R1002型旋转蒸发仪 （上海申顺生物科技有限公司）；eppendorf移液枪 （20～200μL，100～1 000μL）。5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮、高良姜素、山柰素、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮和1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮对照品均为自制，经NMR、MS确定化合物结构，以HPLC法按峰面积归一化法计算，上述5个化合物的对照品纯度均大于98.0%；甲醇 （色谱纯）；超纯水 （自制）；磷酸 （分析纯）。高良姜饮片购自广东徐闻，经海南医学院生药学教研室田建平副教授鉴定为姜科山姜属植物高良姜Alpinia officinarum Hance的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 成分测定方法

2.1.1 色谱条件 Waters sunfire色谱柱（5μm，150 mm×4.6 mm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸水，梯度洗脱 （比例见表1）；体积流量1.0 mL/min；检测波长210 nm［8］；柱温30℃；进样量10μL。

表1 HPLC梯度洗脱程序Tab.1 HPLC gradient eIution programme

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取高良姜素13.24 mg、山柰素4.31 mg、5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮21.66 mg、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮17.67 mg、1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮14.15 mg，分别溶于1.5 mL色谱甲醇溶液中，配制成各对照品母液，稀释10倍，过0.45μm滤膜，即得各对照品溶液。对照品HPLC图谱见图1A。

2.1.3 供试品溶液的制备 高良姜药材粉碎，过4号筛，取5份，每份精密称取5.0 g，按正交试验设计得到9份乙醇溶液提取液。分别稀释5倍，过0.45μm滤膜，即得。供试品HPLC图谱见图1B。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液2、5、10、15、20μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，以峰面积平均值 （Y）为纵坐标，进样量 （X）为横坐标，计算回归方程。5-羟

基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮、高良姜素、山柰素、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮和1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮回归方程见表2。

图1 混合对照品和供试品的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram s of m ixed substances and sam p Ies

2.1.5 精密度试验 分别精密吸取上述对照品溶液10μL，连续进样6次计算。5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮RSD为0.70%、高良姜素为2.40%、山柰素为1.56%、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮为2.07%、1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮为1.72%。表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，测定上述5个化合物的峰面积。5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮RSD为1.57%、高良姜素为1.84%、山柰素为1.66%、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮为2.64%、1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮为2.48%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取高良姜粉末适量，按“2.1.3”项下方法制备6份供试品，按上述色谱条件进行测定，测得5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮、高良姜素、山柰素、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮、1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮平均含有量为13.43、10.56、4.57、2.45、10.05 mg/g，RSD分别为1.26%、1.10%、2.89%、2.49%、2.85%。

2.1.8 加样回收试验 精密称取已知含有量 ［5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮、高良姜素、山柰素、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮、1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮含有量分别为13.43、10.56、4.57、2.45、10.05 mg/g］的高良姜样品粉末，每份约0.1 g，精密称定。用移液枪依次精密加入上述单一对照品溶液0.095、0.12、0.18、0.02、0.11 mL，置同一锥形瓶中，分别按 “2.1.3”项下方法制备6份供试品，进行加样回收试验，计算回收率。结果见表3。

表2 5种成分的回归方程及线性范围Tab.2 Linear reIationships and concentration ranges of five components

2.2 提取工艺优选

2.2.1 方法 精密称取高良姜药材5.0 g，按“2.1.3”项下方法，根据正交试验设计得到9份供试品溶液，按 “2.1.1”项下色谱条件进行测定。

2.2.2 正交试验设计 影响高良姜提取效果的因素有乙醇体积分数 （A）、提取时间 （B）、提取次数 （C）、料液比 （D），在单因素试验基础上确定了60%、70%、80%三个乙醇体积分数，提取时间设立了1 h、1.5 h、2 h三个水平，料液比分别为6倍量、8倍量、10倍量三个水平，因此设计采用了L9（34）正交试验法对高良姜的提取工艺进行考察。

表3 5个成分加样回收率试验Tab.3 Recovery tests for five constituents

2.2.3 最佳工艺确定 采用多指标综合评分法［9-10］，按5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮、高良姜素、山柰素、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮、1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮）权重系数各0.20进行综合评分，以Xij表示第i次试验中第j个指标的测定值，以各指标的最大值作为参照对同一指标各数据进行标准化处理，Dij表示第j个指标下第i个测定值的标准化数据。

其中i=1，2，…，9；j=1，2，3，4，5。由于上述5个化合物均为高良姜中的主要成分，所以权重系数设为0.20，总评分Y按下式计算

Y值越大，表示提取效果越好，以综合评分对试验结果进行直观分析和方差分析，数据处理结果见表4。

表4 5个成分的测定结果Tab.4 Determ ination resu It of five constituents

以综合评分为考察指标对正交试验数据统计分析，结果见表5、表6。

表5 提取工艺正交试验考察结果Tab.5 O rthogona Itest resu It of extraction process

表6 综合评分方差分析Tab.6 AnaIysis of variance of comprehensive evaIuation

由表5、6可知，对高良姜提取工艺中5个主要成分含有量影响最大的是提取次数，其次依次为料液比、乙醇体积分数、提取时间，结果表明高良姜最佳提取工艺为A3B2C3D3，即80%乙醇，提取时间1.5 h，提取次数3次，料液比1：10。对提取时间进一步分析可以看出，提取时间对综合评分值的影响最小，分析实验结果得知，提取1 h和 1.5 h其均值相差仅为0.85，所以综合考虑提取效率和能耗后选择提取时间为1 h，即最佳工艺确定为80%乙醇，提取时间1 h，提取次数3次，料液比1：10。

2.2.4 验证试验 为了进一步验证提取工艺的稳定性，设立3次重复试验对最佳工艺参数进行验证，称取50 g高良姜药材，用80%乙醇提取，提取时间1 h，提取3次，料液比1：10，滤液稀释到线性范围，过0.45μm微孔滤膜，精密吸取10μL注入液相色谱仪，测得5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮、高良姜素、山柰素、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮和1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮的平均质量百分比分别为1.11%、0.88%、0.45%、0.24%、0.89%。平均提取率91%，RSD小于3%，表明该提取工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 影响因素的考察 高良姜中主要化学成分为黄酮类及二苯基庚烷类化合物，这两类成分都属于极性较小的化合物，所以采用乙醇作为提取溶剂可以较好地进行提取，达到较高的转移率。本实验在考察了50%、60%、70%、80%、95%乙醇的基础上，优选出了总评分值较高的3个乙醇体积分数60%、70%、80%；鉴于高良姜是根茎类药材，结合药材前处理后的粉碎粒度将提取时间设立了1 h、1.5 h、2 h三个水平，料液比设为6倍量、8倍量、10倍量三个水平［11］，在此基础上进行正交优选，考察了各影响因素间的交互作用。

3.2 定量测定方法及评价指标的选择 以往实验中以紫外分光光度法测总黄酮来评价提取或纯化工艺，经常出现测定波长选择不合理，背景干扰大，显色反应不稳定，容易受到酚酸类等成分的干扰，

如原儿茶酸的最大吸收波长在258 nm，姜黄素的最大吸收波长在252 nm，和高良姜素的最大吸收波长264 nm很接近［12-13］，在紫外区选择260 nm直接测量容易导致成分定量测定结果误差较大；显色反应后可以在可见光区测量，但显色反应易受到温度、酸碱度、显色时间以及中药提取液本身颜色的干扰［14］，测量结果重复性差，不能很好地指导实际工业生产；也有采用高效液相法进行成分定量测定，以单一高良姜素作为考察指标，虽能准确反映高良姜素的转移率，但不能反映实际提取过程中其他类成分的溶出，尤其是二苯庚烷类成分，本实验以高良姜中含有量较高的5种活性成分的量为指标，采用综合加权评分的方法对正交试验的数据统计处理，科学合理地优选出了高良姜的提取工艺，并进一步验证了该工艺的稳定性和可行性。

3.3 小结 在本实验中高良姜5种成分的转移率分别为5-羟基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮91.7%、高良姜素92.3%、山柰素85.0%、7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-1-苯基-4-烯-3-庚酮94.8%和1，7-二苯基-5-羟基-3-庚酮93.9%，表明该工艺较完全的对高良姜中5种成分进行了提取，并且将二苯基庚烷类纳入综合评价指标进行工艺考察，全面科学地反映了高良姜中多种活性成分的溶出，为后续进一步研究高良姜的药效物质基础，筛选有效部位提供了参考，同时为高良姜药材工业生产过程中的多成分在线监控提供了较好的科学依据。

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Optim ization of ethanoIextraction of Alpinia officinarum bymu Itip Ie com ponents eva Iuation

CHENG Shou-qian1， LIYong-hui2， CHEN Feng2， WEINa2， WANG Yong2， TAN Yin-feng2，LIHai-long2， ZHANG Xiao-po2， ZHANG Jun-qing2*， LIYou-bin1，2*

（1.School of Pharmacy，Nanjing University of Ghinese Medicine，Nanjing 210023，Ghina；2.Hainan Gollege of Medicine，Hainan Provincial Key Laboratory for R&D of Tropical Herbs，Haikou 571199，Ghina）

AIM To optimize the ethanol extraction of Alpinia officinarum.METHOD A high-performance liquid chromatography（HPLC）method was established to simultaneously determine the contents of 5-hydroxy-7-（4-hydroxy-3-methoxy phenyl）-1-phenyl-3-heptanone，galangin，kaempferide，7-（4-hydroxy-3-methoxy phenyl）-1-phenyl-4-ene-3-heptanone and 1，7-diphenyl-5-hydroxy-3-heptanone.With the comprehensive score of the conterts of five components as an indicator，ethanol concentration，extraction time，extraction frequency and the ratio of material to solventwere optimized by L9（34）orthogonal design.RESULTS The extraction frequency played a key role in extraction，and the optimal conditionswere one hour extraction at80%ethanol concentration for three times and 1：10 ratio ofmaterial to solvent.The extraction rates of 5-hydroxy-7-（4-hydroxy-3-methoxy phenyl）-1-phenyl-3-heptanone，galangin，kaempferide，7-（4-hydroxy-3-methoxy phenyl）-1-phenyl-4-ene-3-heptanone and 1，7-diphenyl-5-hydroxy-3-heptanone were 91.7%，92.3%，85.0%，94.8%，and 93.9%，respectively.CONCLUSION Themultiple components evaluation can help tomake a complete extraction，which can be applied as

Alpinia officinarum；orthogonal design；comprehensive evaluation；extraction process

R284.2

A

1001-1528（2015）11-2402-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.014

2015-03-25

海南省重大科技专项 （ZDZX2013008-3）；海口市重点科技计划 （2014030）

程守前 （1989—），男，硕士生，从事中药化学与中药新药研究与开发。Tel：15501896983，E-mail：904019641@qq.com

*通信作者：张俊清 （1964—），女，博士，教授，从事中药质量控制和中药资源学研究。Tel：（0898）66893460，E-mail：jqzhang2011 @163.com李友宾 （1965—），男，博士，研究员，从事中药化学与中药新药研究与开发。Tel：（0898）66895337，E-mail：liyoubinli @sohu.com

an onlinemonitor for Alpinia Officinarum extraction.