穗花杉双黄酮在大鼠体内的药动学研究

王彦志， 张 萌， 刘 阳， 赵会丽， 郑晓珂

（河南中医学院药学院呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南郑州450046）

穗花杉双黄酮在大鼠体内的药动学研究

王彦志， 张 萌， 刘 阳， 赵会丽， 郑晓珂*

（河南中医学院药学院呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南郑州450046）

目的 建立测定大鼠血清中穗花杉双黄酮含有量的方法，并计算其药动学参数。方法 血清样品甲醇液HPLC分析采用C18色谱柱 （250 mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-水 （含0.1%三氟乙酸），梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；检测波长330 nm；柱温30℃；进样量20μL。大鼠灌胃给予穗花杉双黄酮 （60 mg/kg）后，在不同时间点取血，测定血清中该成分的含有量，并计算其药动学参数。结果 穗花杉双黄酮在0.010 04～0.803 2μg/m L范围内的线性关系良好 （r2=0.999 1），血清中该成分在各质量浓度下的回收率均大于80%，Tmax为90 min，Gmax为（0.469±0.046）μg/mL，AUC0-t为（27.731±1.128）mg/（L.min），AUC0-∞为（24.944±1.093）mg/（L.min），t1/2为（57.008±2.765）min，V/F为（198.36±17.422）L/kg，CL/F为（2.408±0.103）L/（min.kg）。结论 该方法准确、可靠，可用于大鼠血清中穗花杉双黄酮的测定及药动学研究。

穗花杉双黄酮；大鼠血清；药动学参数；HPLC

卷柏为卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina（P.Beauv.）Spring或垫状卷柏Selaginellaf pulvinata（Hook.&Grev.）Maxim的干燥全草，具有活血通经之功效，中医临床常用于治疗经闭通经、癥瘕痞块、跌扑损伤等症［1］，其主要有效物质为双黄酮类成分，而其中最主要的是穗花杉双黄酮（amentoflavone，AME）［2］。目前，国内外对穗花杉双黄酮的抗炎、抗氧化、抗病毒［2］、抗肿瘤［3］、降血糖［4］和扩张血管等多种生物活性均有所研究，而且它还具有显著的抗微生物［5］、抗抑郁及抗焦虑作用［6］。正由于穗花杉双黄酮具有显著的药理活性，故国内外正开展针对它的一系列新药研究。

穗花杉双黄酮在化学结构上属于双黄酮类化合物，虽然该类成分在自然界的分布非常广泛，有关其体内代谢的文献也有不少，但其药代动力学研究主要集中在黄酮 （醇）类［7-8］、二氢黄酮 （醇）类［9］、异黄酮类［10-11］、 查尔酮类［12-13］等， 而对双黄酮类化合物的相关研究则相对较少。龚雯等［14］对穗花杉双黄酮在家兔体内的药代动力学进行研究，建立了HPLC法测定家兔血清中该成分浓度的方法，但在处理血清时，需要经过一次沉淀和两次萃取，再吹干溶解，过程相对复杂，回收率不高，因此有待作进一步优化。本实验考察了穗花杉双黄酮在大鼠体内的药动学特征，并优化血清样品的处理过程。

1 材料与仪器

1.1 试剂与药品 甲醇和乙腈均为色谱纯 （美国VBS公司）；三氟乙酸为色谱纯 （天津科密欧化学试剂有限公司）；乙酸乙酯为分析纯 （天津市天力化学试剂有限公司）；娃哈哈纯净水 （杭州娃哈哈集团有限公司）。穗花杉双黄酮对照品 （成都曼思特生物科技有限公司）；穗花杉双黄酮纯品 （自制，纯度＞98%）。

1.2 动物 SD大鼠，雄性，体质量 （220±20）g（济宁市任城区鲁康动物饲料经销中心，许可证号SCXK［鲁］20140001）。

1.3 仪器 Waters2695 HPLC色谱仪，包括Waters2489紫外检测器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；Starsorius BSI电子分析天平（精度0.01 mg，北京赛多利斯天平有限公司）；KQ3200B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDL-40B离心机 （上海安亭科学仪器厂）；氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）；XW-80A涡旋混合仪 （海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈 （A）-水 （B） （含0.1%三氟乙酸），梯度洗脱 （0～5 min，25%A；5～12 min，25%～35%A；12～17 min，35%～45%A；17～25 min，45%～50%A；25～40 min，50%～55%A）；体积流量1.0 m L/min；检测波长330 nm；柱温30℃；进样体积20μL。

2.2 对照品溶液的配制 精密称取穗花杉双黄酮对照品10.04 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度

线，配成1.004mg/mL的对照品贮备液，用甲醇稀释成0.100 4、0.502 0、1.004 0、2.008 0、4.016 0、8.032 0μg/mL一系列对照品溶液，4℃冰箱保存，即得。

2.3 血清样品预处理 取血清200μL，置于5 mL离心管中，加入1 mL乙酸乙酯，涡旋混合2 min，超声1 min，离心5 min（转速4 000 r/min），吸取上层有机相至另一离心管中，下层血清相重复萃取一次，合并，40℃空气流吹干，残留物用200μL甲醇溶解，取20μL进样分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别取按 “2.3”项下方法制成的大鼠空白和给药后的血清溶液20μL，注入HPLC色谱仪，在 “2.1”项色谱条件下进行测定，结果见图1。

由图可知，该方法处理空白和含药血清时，色谱条件适宜，样品中的内源性物质不干扰穗花杉双黄酮的测定，专属性较好。

2.4.2 标准曲线 取大鼠空白血清适量，分别加入按 “2.2”项下方法制得的不同质量浓度的穗花杉双黄酮对照品溶液，涡旋混合，制成血清中含对照品质量浓度为0.010 04、0.050 2、0.100 4、0.200 8、0.401 6、0.803 2μg/mL的含标血清，按“2.3”项下方法进行血清样品前处理，在 “2.1”项色谱条件下进样分析。以穗花杉双黄酮的峰面积为纵坐标 （y），血清中对照品的质量浓度（μg/mL）为横坐标（x）作标准曲线，得到回归方程y=106 725x+1 023.7，r2=0.999 1，线性范围0.010 04～0.803 2μg/mL。

2.4.3 精密度试验 取大鼠空白血清适量，分别加入不同质量浓度的穗花杉双黄酮对照品溶液，涡旋混合，配成低、中、高3个质量浓度的样品进行分析，连续测定3 d，与标准曲线同时进行，按 “2.3”项下方法进行血清样品前处理，进样分析，计算其日内和日间精密度。结果显示，该方法精密度良好，符合药物代谢动力学研究中的样品测定要求，见表1。

表1 精密度试验结果Tab.1 Resu It of precision tests

表1 精密度试验结果Tab.1 Resu It of precision tests

穗花杉双黄酮/（μg.m L-1）平均值/（μg.m L-1） 日内RSD/% 日间RSD/% 0.010 04 0.009 73±0.000 5 2.95 2.87 0.100 4 0.099 5±0.002 5 2.66 2.54 0.803 2 0.789 8±0.003 7 2.13 2.98

2.4.4 回收率试验 取大鼠空白血清适量，分别加入不同质量浓度的穗花杉双黄酮对照品溶液，涡旋混合，配成低、中、高3个质量浓度的样品，按“2.3”项下方法进行血清样品前处理，进样分析，记录峰面积RSD，计算相对回收率。另外，配制相同质量浓度的穗花杉双黄酮对照品溶液，进样分析，记录峰面积RSD，计算两种峰面积的比值，即绝对回收率。结果显示，该方法回收率良好，见表2。

表2 回收率试验结果Tab.2 Resu It of recovery tests

表2 回收率试验结果Tab.2 Resu It of recovery tests

加入量/（μg.m L-1） 测得量/（μg.m L-1） 相对回收率/% RSD/% 绝对回收率/% RSD/% 0.010 04 0.008 97±0.000 23 89.34±2.29 2.54 80.36±2.32 2.89 0.100 4 0.084 5±0.001 0 84.13±0.99 1.18 79.87±2.06 2.58 0.803 2 0.786 3±0.008 9 97.89±1.11 1.13 86.85±3.26 3.75

2.4.5 稳定性试验 配制质量浓度为0.401 6 μg/mL的含标血清样品，考察其置于4℃冰箱5、15、30 d后的质量浓度。结果，测出平均质量浓度为0.390 4μg/m L，RSD为2.41%，表明血清样品在低温下放置30 d内的稳定性良好。

2.5 药动学研究

2.5.1 试验方案与血样采集 称取穗花杉双黄酮纯品适量，加入含0.1%羧甲基纤维素钠（CMCNa）的水溶液，超声混匀，按6 mg/mL的剂量制成混悬液。然后，取SD大鼠5只，灌胃给予混悬液，分别于 0、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300、420 min时断尾取血0.5 mL，置于离心管中离心5 min（转速12 000 r/min），分离血清，-20℃冰箱中保存备用。

2.5.2 未知血清样品的测定 按 “2.3”项下方法进行血清样品前处理，HPLC法进行分析。然后测得的数据经DAS 2.1.1版药代动力学软件处理后，采用非房室模型进行拟合，得到穗花杉双黄酮的药-时浓度曲线和药动学参数 （n=5）。

2.5.3 药动学结果 大鼠灌胃给予穗花杉双黄酮（60 mg/kg）后，其主要药物动力学参数见表3，平均血药浓度-时间曲线见图2。

表3 药动学参数（n=5）Tab.3 Pharmacokinetics parameters（n=5）

图2 穗花杉双黄酮的血药浓度-时间曲线Fig.2 Serum concentration-time curve for am entofIavone

3 讨论

3.1 洗脱条件的选择 由于检测的是单一化合物，本实验前期曾采用等度洗脱，但因血清中内源性物质的干扰，无法测出穗花杉双黄酮的确切浓度。因此，根据文献 ［13］报道，采用梯度洗脱，结果较为理想，故确定洗脱条件为梯度洗脱。

3.2 给药量的确定 根据 《中国药典》规定，以成人每次服用江南卷柏10 g的剂量 （按成人体重60 kg算，即0.166 7 g/kg），并根据人与大鼠的体表面积换算，得出200 g大鼠每次给予卷柏原药材的量为0.166 7 g（即0.826 7 g/kg），相当于穗花杉双黄酮纯品3 mg/kg（所用卷柏药材中穗花杉双黄酮的含有量为1.8%）。在预试验中发现，将此给药量扩大至30 mg/kg后，仍有多个采血时间点的血药浓度无法测出，故根据实验前期对穗花杉双黄酮降血糖活性量效关系的考察结果［6］，将给药量扩大至60 mg/kg。

3.3 药物的配制 在前期实验中，发现穗花杉双黄酮粉末的脂溶性较强，难溶于水，无法灌胃给

药，通过查阅文献，分别应用0.1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）和0.5%吐温-80配制。结果显示，该方法有利于灌胃，而且灌胃剂量准确可靠。

3.4 血样预处理方法的比较 本实验采用甲醇、丙酮沉淀、乙酸乙酯萃取这3种方法处理血清样品，发现用甲醇沉淀蛋白后，虽然空白干扰少，但是回收率较低；用丙酮沉淀蛋白后，回收率较高，但是与空白干扰峰的分离效果不理想；用乙酸乙酯萃取2次后，回收率较高，空白干扰少，操作过程简单，所以选用乙酸乙酯萃取2次进行血样预处理。

3.5 药动学研究 实验结果表明，大鼠口服穗花杉双黄酮后，在90 min时达到最高血药浓度，与文献 ［14］报道的75 min相近，而且表观分布容积（V/F）为 （198.36±17.422）L/kg，表明大鼠口服穗花杉双黄酮后，药物大量分布或储存在某些组织器官中。

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Pharm acokinetics study on am entofIavone in rats

WANG Yan-zhi， ZHANGMeng， LIU Yang， ZHAO Hui-li， ZHENG Xiao-ke*

（School of Pharmacy，Henan University of Traditional Ghinese Medicine；Gollaborative Innovation Genter for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment and Henan Provincial Ghinese Medicine Development，Zhengzhou 450046，Ghina）

AIM To establish amethod for determining amentoflavone in rat serum and calculate its pharmacokinetics parameters.METHODS HPLC analysis of serum methanolic extract of AME was performed on C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with acetonitrile-water（including 0.1%trifluoroacetic acid）asmobile phase at a flow rate of1.0 mL/min，the detection wavelength of330 nm，the column temperature of 30℃and the sample injection volume of 20μL.After intragastric administration of amentoflavone（60 mg/kg），rat serum was collected and checked for the plasma concentration at different intervals，then the pharmacokinetics parameters were obtained.RESULTS Amentoflavone had a good linear relationship within the range of0.010 04-0.803 2μg/mL（r2=0.999 1），whose recovery at different concentrations in rat serum wasmore than 80%，and the Tmax，Gmax，AUC0-t，AUC0-∞，t1/2，V/F and CL/F were 90 min，（0.469±0.046）μg/m L，（27.731±1.128）mg/（L.min），（24.944±1.093）mg/（L.min）， （57.008±2.765）min， （198.36±17.422）L/kg and（2.408±0.103）L/（min.kg），respectively.CONCLUSION This accurate and reliable method can be applied to determining amentoflavone and conduct pharmacokinetics research in rat serum.

amentoflavone；rat serum；pharmacokinetics parameters；HPLC

R969.1

A

1001-1528（2015）11-2397-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.013

2014-12-12

“十二五”国家重大新药创制科技重大专项 “降糖新药卷柏黄酮的研究”（2013ZX09102-022）

王彦志 （1976—），女，博士，教授，硕士生导师，研究方向为中药药效物质基础。Tel：（0371）65962746，E-mail：wangyzlb@126.com

*通信作者：郑晓珂 （1961—），女，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药药效物质作用机理。E-mail：zhengxk.2006@163.com