用HPLC法测定地黄叶中毛蕊花糖苷的含量

·技术和方法·

用HPLC法测定地黄叶中毛蕊花糖苷的含量

王亮1，张巧艳1,年华2，李华强1，3，李云华4，秦路平1*

(1.第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药学部，上海 200437；3.上海师范大学生命与环境科学学院植物学教研室，上海 200234；4.上海沪丰生物科技有限公司，上海 200433)

[关键词]毛蕊花糖苷；地黄叶;含量测定；色谱法, 高效液相

[中图分类号]R927.2[文献标志码]B

DOI：10.5428/pcar20150108

作者简介王亮(男),硕士生.E-mail:wangjizuliang@163.com

[收稿日期]2014-01-16

*通信作者(Corresponding author)：秦路平，E-mail:qinsmmu@126.com

地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)为玄参科多年生草本植物。其根含有环烯醚萜苷、氨基酸和糖类等多种化学成分，具有提高免疫力、增强造血功能、抗肿瘤和抗阴虚等多方面的药理作用，收载于历版《中华人民共和国药典》中。近年研究发现，地黄叶含有丰富的毛蕊花糖苷[1]。根据文献报道，毛蕊花糖苷具有显著的免疫调节作用[2]，在治疗慢性肾脏病[3]、肾毒血清肾炎[4]等方面具有显著的疗效。本研究建立了用HPLC法测定地黄叶中毛蕊花糖苷的方法，为地黄叶的质量研究和资源开发利用提供参考。

1仪器和试药

1.1仪器和试剂Agilent 1200系列高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器、Chemstation10.2 工作站(美国Agilent公司)；BP211D 十万分之一电子天平(德国Sartorius公司)；USC-702超声波清洗仪(上海波龙电子设备有限公司)。乙腈(色谱纯，批号20130910)、冰乙酸(色谱纯，批号20130904，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(分析纯，批号20130815，上海斯炯化工科技有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；毛蕊花糖苷(含量>99%，上海融禾医药科技有限公司)。

1.2药材地黄叶采自河南省焦作市温县(批号为20131001、20131002、20131003)，由上海和净新能源科技有限公司提供，经第二军医大学药学院生药学教研室秦路平教授鉴定为玄参科植物地黄 (RehmaniaglutinosaLibosch.) 的叶。

2方法和结果

2.1溶液的配制(1)对照品溶液精密称取干燥至恒重的毛蕊花糖苷对照品2.17 mg，置5 ml量瓶中，用甲醇溶解, 稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.434 mg/ml的对照品溶液。(2)供试品溶液 取新鲜药材剪成约为0.5 cm小块，

50 ℃

减压干燥20 h，粉碎成粗粉，精确取样品0.8 g，置100 ml带塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，超声提取30 min，静置5 min后再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置5 min，过滤，收集提取液。同法用50 ml甲醇重复提取2次。合并提取液，摇匀，静置5 min后，精密量取10 ml溶液，减压浓缩至近干，残渣用流动相乙腈-0.1%乙酸溶液(16∶84)[5]溶解并转移至5 ml量瓶中，定容，摇匀，即得。

2.2色谱条件Agilent 1200 系列高效液相色谱仪；Eclipse-XDB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；流动相见2.1(2)项；流速 1.0 ml/min; 检测波长：334 nm；进样量：20 μl。地黄叶的HPLC谱图见图1。

2.3标准曲线的制备取2.1(1)项下对照品溶液，按2.2项下色谱条件分别进样1、2、4、8、12、16、20 μl，记录色谱图和峰面积，以峰面积积分值(Y)对毛蕊花糖苷的量(X)作线性回归， 绘制标准曲线， 得毛蕊花糖苷的标准曲线方程为：Y=822 182X+13.2，r=0.999 9，线性范围为0.434～8.68 μg。

2.4稳定性实验取同一批号供试品溶液(批号20131001)，分别于0、2、4、8、10、12 h，按2.2项下色谱条件进行测定。结果毛蕊花糖苷峰面积RSD为1.56%(n=3)，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.5重复性实验取同一批号样品(批号20131001)，按2.1(2)项下方法平行制备6份供试品溶液，再按2.2项下色谱条件分别进样测定，计算毛蕊花糖苷峰面积RSD为1.08%(n=3)，表明方法重复性良好。

2.6精密度实验取2.1(1)项下对照品溶液，按2.2项下色谱条件重复进样6次，结果毛蕊花糖苷峰面积RSD为1.53%(n=3)，表明仪器精密度良好。

2.7加样回收率实验精密称取同一批(批号20131001)已知含量的地黄样品6份，加入一定量的毛蕊花糖苷对照品，按照2.1(2)项下方法制备供试品溶液，测定毛蕊花糖苷的含量，计算回收率及其RSD值，结果毛蕊花糖苷的平均回收率为98.05%，RSD为4.40% (n=6)，具体见表1。

2.8样品含量测定取地黄药材，按2.1(2)项下方法制备3批供试品溶液， 按2.2项下色谱条件进行测定， 计算含量。 结果批号为20131001、 20131002、 20131003 的地黄叶样品中毛蕊花糖苷的含量分别为(25.83±0.34)、(25.08±0.43)、(25.57±0.05) mg/g生药，平均含量为(25.49±0.38) mg/g(n=3)。

3讨论

本研究建立了地黄叶中毛蕊花糖苷的HPLC含量测定方法。研究中，作者比较了药材干燥方式和提取方法对毛蕊花糖苷含量的影响。在80 ℃温度下，干燥24 h，地黄叶中毛蕊花糖苷的含量降低20%左右，表明温度和干燥时间影响地黄叶中毛蕊花糖苷的含量。在提取方法上，作者比较了加热回流和超声提取对地黄叶中毛蕊花糖苷含量的影响，加热回流提取地黄叶中毛蕊花糖苷的含量降低30%左右。超声提取所需时间短，提取率高，一次提取其转移率即可达80%以上，最终确定超声处理3次提取地黄叶中的毛蕊花糖苷。

有文献报道应用甲醇-冰乙酸-水作为流动相可对地黄叶中的毛蕊花糖苷进行良好的分离[6]。作者比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸等流动相，发现乙腈-0.1%乙酸有较好的分离效果，所以最终选择乙腈-0.1%乙酸为流动相。本研究所建立的HPLC法可以使毛蕊花糖苷与药材中的其他成分达到基线分离，分析时间短，结果准确、可靠。

【参考文献】

[1]边宝林, 何伟, 王宏洁. 地黄叶中具有治疗慢性肾小球肾炎作用的毛蕊花糖苷的制备工艺:中国, 200610104355.0[P].2008-02-13.

Bian BaoLin, He Wei, Wang HongJie. The preparation technology of verbascoside used to treat chronic glomerulonephritis in Rehmannia leaves: China, 200610104355.0[P]. 2008-02-13.In Chinese.

[2]高莉，彭晓明，霍仕霞，等.毛蕊花糖苷改善D-半乳糖致亚急性衰老小鼠脑损伤的作用[J].中草药，2013，44(24)：81-85.

Gao Li, Peng XiaoMing, Huo ShiXia,etal.Effect of acteoside on cerebral injury in subacute aging mice induced byD-galactose[J].Chin Tradit Herbal Drugs, 2013，44(24)：81-85.In Chinese with English abstract.

[3]柳文晶,王群元,刘清,等. 地黄叶总苷胶囊联合肾炎康复片治疗慢性肾脏病44例疗效观察[J].河北中医，2013,35(3)：408-410.

Liu WenJing, Wang QunYuan, Liu Qing,etal. Clinical observation of the treatment of 44 cases of chronic kidney disease with Dihuangye total glycoside capsule combined with Shenyankangfu tablets[J].Heibei J Tradit Chin Med, 2013, 35(3): 408-410. In Chinese with English abstract.

[4]熊玉兰, 王金华，屠国瑞，等. 熟地黄麦角甾苷对小鼠肾毒血清肾炎治疗作用的研究[J].世界科学技术:中医药现代化,2006,8(5):46-48.

Xiong YuLan, Wang JinHua, Tu GuoRui,etal. Therapeutic effects of Radix Rehmanniae Preparata Acteoside’s on nephrotoxic sera nephritis in mice[J].World Sci Technol/Mod Tradit Chin Med Mater Med,2006,8(5):46-48.In Chinese with English abstract.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典.2010年版 一部[M].北京:中国医药科技出版社，2010:115-116.

State Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. 2010 ed.Volume 1[S]. Beijing: Chinese Medical and Science Press, 2010:115-116. In Chinese.

[6]边宝林,王宏洁,杨健. 5种不同药材中毛蕊花糖苷的含量比较[J].中国中药杂志，2010,35(6)：739-740.

Bian BaoLin, Wang HongJie, Yang Jian.Comparison of verbascoside content in five different herbs[J]. China J Chin Mater Med,2010,35(6)：739-740.In Chinese.

[修回日期]2014-12-22

[本文编辑]阳凌燕