缝隙连接蛋白及其在牙髓组织中的表达和作用

闫胜男, 刘富萍, 李 贺, 王舒煜, 张 琦 综述; 张志民 审校

(吉林大学口腔医学院, 吉林 长春 130000)

缝隙连接蛋白及其在牙髓组织中的表达和作用

闫胜男, 刘富萍, 李 贺, 王舒煜, 张 琦 综述; 张志民 审校

(吉林大学口腔医学院, 吉林 长春 130000)

缝隙连接作为电突触的结构基础及相邻细胞间的通讯通道，近年来倍受关注, 其主要组成蛋白——缝隙连接蛋白参与了多种疾病的发生发展，从而为预防和治疗疾病提供了重要的依据。本文就缝隙连接蛋白及其在牙髓组织中的表达和作用作一综述。

缝隙连接蛋白; 缝隙连接; 炎症; 牙髓组织

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.12.013

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(12): 754]

缝隙连接蛋白(connexin,Cx)广泛存在于哺乳动物的细胞内，目前已发现的人类基因编码的Cx有21种亚型，主要根据其分子量大小进行命名，如分子量为26、32、43 KD者，则命名为Cx26、Cx32、Cx43[1]。Cx除参与细胞自身的生长、分裂、分化及凋亡等过程外，其所介导的缝隙连接通道(gap junction channel,GJC)在调节细胞间的信息交流过程中也有重要作用。临床上很多研究均发现，Cx可调节基因的表达及细胞迁移，与细胞生长、分化、创面愈合、瘢痕形成、心血管疾病、肿瘤及神经系统等多种疾病的发生密切相关。目前，关于Cx与牙生长、发育及龋损发生发展等的关系在国外已有初步研究，国内尚未有这方面的报道。本文就Cx及其在牙髓组织中的表达和作用作一综述。

1 缝隙连接(gap junction，GJ)概述

1.1 GJ的结构

GJ是指相邻细胞间的跨膜通道，其所构成的细胞缝隙连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)能够调节各种生理过程。自Robertson[2]于1963年首先详细描述了细胞间存在着一个呈六角形排列的格子(lattice)，即缝隙连接以后，许多学者都对其结构和功能进行了大量研究，到上世纪80年代对GJ的认识已相当深入。GJ由一对连接小体(hemichannel)组成，两个连接小体分别贯穿于相邻细胞相对的细胞膜中，每个连接小体均由6个连接蛋白(connexin)分子聚合而成(6个链接蛋白分子呈环行排列，并在中间形成小孔)。6个相同的连接蛋白可组成连接小体的同源聚合体，而6个不同的连接蛋白则可组成连接小体的异源聚合体。一对连接小体相互对合，即可利用各自的小孔共同构成孔道结构，即缝隙连接通道，可允许小分子物质和离子自由进出[3]。Cx及其介导的缝隙连接结构如图1[4]所示。

连接蛋白分子结构包括4个跨膜区域，4个细胞外环(EL1～2)和1个细胞内环(CL)，两端分别是胞内侧的氨基(NT)和羧基(CT)

图1 Cx及其介导的缝隙链接结构

1.2 GJ的功能

GJ可在细胞间传递离子、小分子等代谢物质及次级信使，且具有传导快、低阻抗、延搁时间短等特点。近期研究发现，GJ并不仅是细胞间物质传递的通道，除参与细胞间活动的协调、信息传递以及神经脉冲的传导生成、蔓延和调控过程外，还可过滤电信号，与细胞的代谢和分化、物质的运输和电兴奋的传导等均有密切关系；其在胚胎发育、形态发生、组织再生及肿瘤中均起着重要的作用[3，5]。目前已证实，采用化学方法抑制GJIC的功能后，可影响细胞周期；在小鼠脂肪细胞培养中使用GJ阻滞剂18-α甘草次酸、庚醇或生胃酮时，能抑制克隆过程中的细胞有丝分裂过程；在人类肺成纤维细胞培养中使用顺铂，则可诱导GJC在细胞的 G1/S 期时关闭，从而使p53表达增多并诱导细胞早衰[4]。

2 Cx的作用

2.1 Cx的结构

Cx是一种跨膜蛋白，首先在细胞的内质网中合成并在高尔基体聚合成半通道，然后再通过高尔基体转运至细胞膜。目前在哺乳动物体内已发现的Cx有20余种亚型，它们共享1个分子结构，即4个跨膜区域、2个细胞外环和1个细胞内环，两端分别是胞内侧的氨基和羧基，通常在细胞膜的特定区域以六聚体形式形成GJC及连接蛋白半通道，并允许分子量小于1 KD 的小分子物质如 Ca2+、NAD+、ATP等自由通过，从而形成缝隙连接的细胞间通讯功能(GJIC)[4-6]。

2.2 Cx的非通讯功能

临床研究发现，Cx43表达可影响缝隙连接的形成和功能，如Cx43表达上调可增强缝隙连接的通讯功能[7]。目前已证实，Cx43在心肌缺血预处理中有心肌保护作用[1]。近年来，对Cx家族的研究范围已经扩展到心脏以外的其他器官。临床研究表明，在肿瘤(如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和其他癌症)的组织中，可观察到Cx的表达缺乏或异常，根据已有的相关研究成果猜测，Cx可通过传输信号分子及调节细胞增殖、迁移和凋亡而抑制肿瘤的生长，并认为这种对癌症的影响行为可能取决于Cx本身，而不是细胞间的耦合[8]。有学者将新生小鼠的纯化施万细胞与坐骨神经胶质生长因子2(GGF2，Nrg1的同种类型)共同培养时发现，在初代培养中可见Cx32表达上调；若敲除小鼠施万细胞中的Cx32基因，则仅对促进细胞有丝分裂的GGF2因子有较小的回应，也未增加施万细胞间的电耦合[5]。以上结果说明，Cx32的表达异常与否与细胞分裂有直接作用，并进一步证实Cx本身对癌症有影响作用。另有研究发现，阻止Cx43表达能降低小鼠P19癌细胞系神经元的发育成熟速度，表明Cx43在神经系统成熟中起核心作用[9]。目前已明确，Cx43除对大脑细胞的迁移有影响作用，还能加速伤口肉芽组织的形成和重塑，从而促进组织愈合[2]。

2.3 Cx在炎症中的作用及可能的机制

炎症是一系列复杂的病理过程，包括细胞因子、生长因子、趋化因子的释放，以及中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等炎细胞由血液向组织间隙的迁移，这些过程均需要细胞间通讯功能的协调和参与，而缝隙连接所形成的跨膜通道则可为邻近细胞提供直接的物质信息交换途径[10]。在缺氧环境、细胞因子和其他因素的作用下，有学者假设线粒体Cx43可激活白细胞并使活性氧ROS大量生成。大量ROS可以激活氧化还原反应敏感的信号转导通路和转录因子,使之参与炎症反应的始动。这些转录因子包括NF-KB、activator protein(AP)-l, 它们可通过对粘附分子和炎症性细胞因子进行调控而引起基因表达编码蛋白，以适应机体的缺氧和炎症反应；而炎症反应又可激活内皮细胞、白细胞、血小板，从而使这些活化的细胞通过表达粘附分子和促炎症反应因子引起内皮细胞的损伤和功能障碍[11-12]。以上过程可能就是Cx43的表达在炎性疾病中的作用机理。

3 Cx与牙髓组织

3.1 牙髓组织

牙髓是来源于外胚间叶的疏松结缔组织，位于牙本质所形成的髓腔内，具有形成牙本质、营养、感觉、防御和修复等功能。牙髓组织中含有细胞、神经、血管、淋巴管和其他细胞外基质，可分为4层，即靠近牙本质的成牙本质细胞层、紧邻成牙本质细胞层的乏细胞层(又称Weil层)、无细胞内侧的多细胞层和牙髓中央区的固有牙髓(也称髓核)。牙髓中的细胞主要有成牙本质细胞、成纤维细胞、组织细胞、未分化间充质细胞及树突状细胞等[13]。其中，成纤维细胞是牙髓中的主要细胞，故又称牙髓细胞，具有合成胶原蛋白、胶原蛋白酶、蛋白聚糖及糖胺聚糖等功能。当前期牙本质受到刺激时，牙髓多细胞区的成纤维细胞(dental pulp fibroblasts，DPFs)可分化为成牙本质细胞并形成修复性牙本质[14]；若刺激进一步加重，则可使牙髓组织充血，甚至发展为牙髓炎；当牙髓由于感染等发生炎症时，则难以完全的修复性再生，这对临床牙髓病的治疗具有参考价值[13]。

3.2 Cx在牙髓组织中的表达及定位

Koling等[15]采用冷冻断裂实验及电子显微镜观察发现，GJ存在于成牙本质细胞间及成牙本质细胞与邻近成牙本质细胞层的细胞间。大量GJ可通过提供细胞间信号分子通道，以维持统一的细胞活动，并使之形成均匀一致的前期牙本质层，在牙齿发育过程中起重要作用[13]。Beyer等[16](1989)研究发现，Cx43在成纤维细胞中有表达。近年来有研究发现，成纤维细胞中除表达Cx43外，还有其他Cx的表达。Fried等[17]采用免疫组化的方法研究时发现，老鼠牙髓组织在发育过程中及受伤时均有Cx26、Cx32、Cx43的表达；在早期分化阶段，即成釉细胞合成和分泌釉基质蛋白时有Cx32和Cx43的表达，其中Cx32主要在上皮细胞中表达，而Cx43则广泛分布于上皮细胞和间充质细胞中，并同时还表达于分化期和功能型(即能分泌牙本质基质)的成牙本质细胞中。而在成年老鼠的牙中，仅观察到Cx26和 Cx43在成牙本质细胞层呈或低或高水平的表达，并未发现有Cx32的表达。

3.3 Cxs在牙髓组织中的作用

Cxs是以分子量为基础命名的跨膜蛋白家族，在不同的组织中均有表达，最初以形成细胞间通道——缝隙连接而闻名。GJ所介导的细胞间通讯功能在维持和调节正常牙体组织生长过程中有重要作用[17]。Fried等[18]报道，在老鼠牙髓的发育期、发育完成期及病理状态下均有Cx的表达，说明Cx可能与牙髓组织的生长、发育及病理生理等过程有关。Ibuki N等[14]研究发现，在牙髓组织中有Cx32和Cx43的双重表达，特别是在多细胞区的DPFs中Cx32表达更强烈；从而可推测：牙髓多细胞区的DPFs可产生一些蛋白质并能诱导牙髓多细胞区的细胞分化为成牙本质细胞,而Cx32在多细胞区的高表达则说明其可保护牙髓组织免受来自牙本质小管的各种刺激,以防龋损的发生。Centeno等[17]通过控制幼鼠饮用水中的氟浓度以模拟氟斑牙的形成，经半定量RT-PCR技术和碱性磷酸酶活性测定发现，氟能改变小鼠切牙牙髓组织中不同类型Cxs的表达水平及碱性磷酸酶(ALP)活性；提示，相关Cxs的表达可能参与调整离子和小分子物质在细胞间传递的渗透率，并通过控制和维持体内蛋白质的基因表达平衡来适应体内氟含量的增高，从而影响牙的矿化。

3.4 Cx43

目前，研究Cx43相关的报道较多。Imad About等[19]研究发现，在牙发育中，Cx43主要定位于上皮细胞和间叶细胞，并与细胞的分化程度相关。Cx43在正常恒牙的成牙本质细胞及其分化过程中均有表达，而在龋损的成牙本质细胞中的表达量则明显上调，说明其可能与修复性牙本质的形成有关。现已证实，Cx43介导的缝隙连接在硬组织形成过程中起重要作用，它们在组织发育过程中可允许小于1.2 KD的小分子包括细胞内Ca2+自由通过。有研究发现，Cx43的表达上调先于牙的发育及骨的形成，若在小鼠胚胎时期禁止Cx43的表达，则可导致所有类型骨的发育和矿化且出现严重缺陷，并可使牙的发育和萌出延迟；提示，Cx43在骨髓、牙髓干细胞的分化及矿化过程中起着重要的作用[20]。

Murakami等[21](2001)研究发现，Cx43在小鼠切牙的成牙本质细胞和牙髓细胞中均有表达，表明Cx43在年轻成牙本质细胞中高度表达。Murakami[22]采用免疫电镜检测成牙本质细胞中的Cx43时发现，在细胞胞体间及细胞代谢过程中均存在由Cx43介导的缝隙连接；同时还发现，这种结构只存在于成牙本质细胞的代谢过程中，而在施万细胞或神经纤维中则未发现此结构。近年来有学者还发现[23]，Cx43在细胞循环中可能是一种负调节蛋白，可通过其负调节作用而抑制细胞的过度繁殖。另有研究发现，老鼠牙髓组织细胞间所存在的由Cx43介导的GJ与碱性磷酸酶活性有关，当牙本质敏感及疼痛时，成牙本质细胞中有Cx43的表达并伴随有信号传导及ATP释放；说明Cx43在牙髓激惹状态中有重要作用，并可作为牙髓细胞生长、分化及磷酸酶活性等的标志[24-25]。

4 小结

GJ是细胞间物质交换特有的跨膜通路，Cx作为组成此通路的主要蛋白近年来备受关注，并在不同组织和器官中均发现有不同类型的Cx的存在；而且其表达异常与生长、发育及多种疾病的发生发展相关。关于Cx与疾病的关系，在心肌缺血及肿瘤方面的研究较多，并发现Cx在参与疾病发生发展的过程中有不同的机制。迄今为止，已有国外学者发现牙髓组织中也含有Cx43、Cx32和Cx26，并发现这些Cx与牙髓组织的发育、分化及病理生理过程关系密切。但关于Cx是否参与牙髓炎症的发生、发展及其具体作用机制，目前尚未有学者研究报道，如果能明确Cx的作用机制，将会在攻克牙髓炎方面迈进一大步。

[1]Catheleyne D, Raf P, Humbert DS,etal. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions [J].BioEssays, 2009，31(9):953-974.

[2]Robertson JD.The occurrence of a subunit pattern in the unit membranes of club endings in Mavthner cell synapses in goldfish brains[J].CellBiol,1963,10:201-221.

[3]Shimizu K,Stopfer M.Gap junctions[J].CurrentBiol, 2013,23(23):1026-1031.

[4]Vinken M, Decrock E,De Vuyst E,etal.Connexins: sensors and regulators of cell cycling[J].BiochimBiophysActa, 2011,1815(1):13-25.

[5]Zhou JZ,Jiang JX.Gap junction and hemichannel- independent actions of connexins on cell and tissue functions - an update[J].FEBSLett, 2014,588(8):1186-1192.

[6]Tarzemany R, Jiang G, Larjava H,etal.Expression and function of connexin 43 in human gingival wound healing and fibroblasts[J].PLoSOne, 2015,10(1):e0115524.

[7]Wang CY,Liu HJ,Chen HJ,etal.AGE-BSA down-regulates endothelial connexin43 gap junctions[J].BMCCellBiol, 2011,16:12-19.

[8]Cronier L, Crespin S, Strale PO,etal.Gap junctions and cancer: new functions for an old story [J].AntioxidRedoxSignal, 2009,11(2):323-328.

[9]Ellis KM,O′Carroll DC,Lewis MD，etal.Neurogenic potential of dental pulp stem cells isolated from murine incisors[J].StemCellResTher, 2014,5(1):30.

[10]Scheckenbach KE,Crespun S,Kwak BR,etal.Connexin channel dependent signaling pathways in inflannation[J].JVascRes, 2011,48(2):91-103.

[11]Wang R, Huang F, Chen Z,etal.Downregulation of connexin 32 attenuates hypoxia/reoxygenation injury in liver cells[J].JBiochemMolToxicol, 2015,29(4):189-197.

[12]Le HT, Sin WC, Lozinsky S,etal.Gap junction intercellular communication mediated by connexin43 in astrocytes is essential for their resistance to oxidative stress[J].JBiolChem, 2014, 289(3): 1345-1354.

[13]于世凤. 口腔组织病理学 [M]. 6版 . 北京: 人民卫生出版社, 2011:64-66.

[14]Ibuki N, Yamaoka Y, Sawa Y,etal. Different expressions of connexin 43 and 32 in the fibroblasts of human dental pulp[J].TissueCell, 2002,34(3):170-176.

[15]Koling A, Rask-Andersen H, Gagger-Sjoback D. Membrane junctions on odontoblasts: A freeze-fracture study[J].ActaOdontolScand,1981,39:355-360.

[16]Beyer EC, Kistler J, Paul DL,etal. Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kDa protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues[J].CellBiol,1989,108:595-605.

[17]Centeno VA, Fontanetti PA, Interlandi V,etal.Fluoride alters connexin expression in rat incisor pulp[J].ArchOralBiol, 2015,60(2):313-319.

[18]Fried K,Mitsiadis TA,Guerrier A,etal. Combinatorial expression patterns of the connexins 26, 32, and 43 during development, homeostasis, and regeneration of rat teeth[J].IntJDevBiol,1996,40(5):985-995.

[19]Imad A, Jean-Pierre P, Sylva R,etal.In vivo and in vitro expression of connexin43 in human teeth[J].ConnectiveTissueResearch,2002, 43: 232-237.

[20]Syed-Picard FN, Jayaraman T, Lam RS,etal.Osteoinductivity of calcium phosphate mediated by connexin 43[J].Biomaterials, 2013,34(15):3763-3774.

[21]Murakami S, Muramatsu T, Shimono M.Expression and localization of connexin 43 in rat incisor odontoblasts[J].AnatEmbryol(Berl), 2001,203(5):367-374.

[22]Muramatsu T, Hashimoto S, Shibukawa Y,etal. Immunoelectron microscopic observation of connexin43 in rat odontoblasts[J].MicroscResTech, 2013,76(10):988-991.

[23]Liu X, Yu L, Wang Q,etal.Expression of ecto-ATPase NTPDase2 in human dental pulp[J].JDentRes, 2012,91(3):261-267.

[24]Muramatsu T, Hamano H, Ogami K,etal. Reduction of connexin 43 expression in aged human dental pulp[J].IntEndodJ, 2004,37(12):814-818.

[25]Chung CK, Muramatsu T, Uekusa T,etal. Inhibition of connexin 43 expression and function in cultured rat dental pulp cells by antisense oligonucleotide[J].CellTissueRes, 2007,329(2):295-300.

Connexin proteins and research progress on connexins of dental pulp

YAN Sheng- nan, LIU Fu- ping, LI He, WANG Shu- yu, ZHANG Qi, ZHANG Zhi- min

(SchoolandHospitalofStomatology,JilinUniversity,Changchun130000,China)

Gap junction has attracted more and more attention in recent years because it plays the basic roles in electrical synapse structure and intercellular channel of communication. Connexins, the main composite proteins of gap junction, have been reported to be involved in the development of many diseases. This article reviews the research progress on connexins and the relationship between connexins and dental pulp.

connexin; gap junction; inflammation; dental pulp

2015-03-31

国家自然基金项目(81170945)

闫胜男(1989-)，女，汉族，河南商丘人。硕士生(导师：张志民)

张志民，E-mail：zhangzm1964@sina.com

R780.2

A

1005-2593(2015)12-0754-04