玉米异羟肟酸类物质的分泌与其耐铝性的关系

唐新莲，郭添香，高小凤，黎晓峰，顾明华

广西大学农学院，广西 南宁 530004

玉米异羟肟酸类物质的分泌与其耐铝性的关系

唐新莲，郭添香，高小凤，黎晓峰，顾明华

广西大学农学院，广西 南宁 530004

铝毒是植物在酸性土壤中生长的主要限制因子，由于生长环境的差异，植物进化出不同的策略来抵抗铝毒害。阐明这些机理，将有助于开发抗铝毒农作物新品种。大部分陆生植物利用根系分泌一些有机酸来对付铝毒害，但根系分泌的异羟肟酸类物质（丁布和门布等）与玉米的耐铝能力的关系尚未见报道。收集中国56个主栽玉米（Zea mays）品种，设置铝胁迫试验，测定它们在铝的胁迫下根系异羟肟酸的分泌量、根伸长量、根尖胼胝质的质量分数和铝质量分数，分析了根系分泌的异羟肟酸与玉米耐铝能力的相关性。结果表明，铝可诱导玉米根系分泌异羟肟酸；用铝处理后，玉米根伸长受阻，根尖铝质量分数和胼胝质质量分数增加。在铝的胁迫下，根相对伸长率与异羟肟酸分泌量呈极显著正相关（r丁布=0.455 0**，r门布= 0.600 8**），而根尖铝质量分数与异羟肟酸分泌量呈极显著负相关（r丁布=-0.354 2**，r门布=-0.484 1**），根尖胼胝质质量分数与异羟肟酸分泌量也呈负相关（r丁布=-0.365 1**，r门布=-0.135 1）。并且，聚类分析表明耐铝型的30个玉米品种在铝胁迫下根系分泌异羟肟酸的能力显著高于铝敏感型的7个品种。这些研究结果表明，铝诱导的根系分泌异羟肟酸类物质可能是一些耐铝玉米品种抵御铝毒害的一种机制。

玉米；铝；异羟肟酸

土壤酸化是本世纪人类面临的严峻的农业和生态问题。Guo等（2010）的研究表明，从 1980至2000年的20年间，中国主要农业生态系统中的土壤酸化非常严重。伴随着土壤酸化而产生的铝毒问题是限制热带、亚热带地区作物生长的主要因素。然而，植物可通过某些机制适应铝胁迫的土壤环境。有机酸可将根际土壤中的铝螯合成无毒的形态，因此，铝诱导根系分泌被公认为重要的抗铝机制（Kochina等，2015；左方华等，2010；Ryan等，2009；Yang等，2006；Li等，2009，2000）。另一方面，玉米（Zea mays）是种植在酸性土壤上的重要禾谷作物，玉米对 Al毒胁迫的抗性较小麦（Triticum aestivum）、大麦（Hordeum vulgare）的强。在一些品种中，铝诱导根系分泌有机酸是玉米抵御铝毒的有效机制（Pellet等，1995；Jorge和Arruda，1997）。然而，有机酸的分泌假说不能很好地解释一些玉米的耐铝性（Piñeros等，2005），因此，推测可能还有其他未确定的机制可解除铝对玉米的毒害。

异羟肟酸类化合物（2, 4-二羟基-2H-1, 4-苯并噁嗪-3(4H)-酮，也称氧肟酸）是禾本科植物重要的次生代谢产物。玉米根、茎、叶器官中均含有异羟肟酸。丁布（DIMBOA，2, 4-二羟基-7-甲氧基-1，4-苯并噁嗪-3-酮）是玉米中最丰富的异羟肟酸类物质。门布（MBOA，6-甲氧基-3-苯并噁啉-3-酮）也是玉米中另一种重要的异羟肟酸类物质（Xie等，1991）。玉米根中的异羟肟酸对离子有很强的亲合力（Simcox和Weber，1985）。玉米根系也能分泌较多的异羟肟酸。玉米根系分泌的异羟肟酸物质包括丁布、丁布的内酰胺前体及其分解物（如苯并噁唑啉酮）等物质。有研究结果暗示，铝诱导玉米根系分泌的异羟肟酸结构类似物类黄酮类酚醛能减轻铝对玉米的毒害（Kidd等，2001；Poschenrieder等，2005；Tolra等，2009）。然而，通过根系分泌的异羟肟酸类化合物获得抵御铝毒能力的机制的研究尚未见报道。因此，本文收集了国内主栽的56个玉米品种，研究了铝胁迫下根系异羟肟酸类物质分泌、根伸长、根尖铝质量分数、根尖胼胝质质量分数及品种间的差异，分析了异羟肟酸类物质分泌与耐铝性的关系，为探明玉米耐铝机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试植物材料

供试玉米（Zea mays L.）品种共56个，见表1。

表1 不同玉米品种铝胁迫下相对伸长率Table 1 Effect of Al on relative root elongation in different maize cultivars

1.2 植株培养

将供试玉米种子的包衣冲洗干净后，室温下浸种14 h，25 ℃暗中催芽。种子露白后用0.5 mmol·L-1CaCl2溶液（pH=4.5）于人工气候箱中培养，每天更换CaCl2溶液，光周期为昼14 h、夜10 h，光照强度5000 lx，温度为昼25 ℃、夜20 ℃，培养4～5 d，选取根长约4～6 cm、大小一致的幼苗作为供试材料。

1.3 根伸长量的测定

供试玉米幼苗用0、10 µmol·L-1AlCl3溶液（含0.5 mmol·L-1CaCl2，pH4.5）处理24 h。处理前后分别测量幼根的长度。2次测量值之差即为玉米幼苗根的伸长量。每个品种每个处理共测量15株幼苗。根的相对伸长率按以下公式计算：

根伸长量(Root regenerate lengths, RRL)=最终根长-初始根长；

1.4 根尖胼胝质质量分数及铝质量分数测定

按“1.3”节的方法处理了24 h的玉米经去离子水浸洗后，切取1 cm根尖，测定胼胝质和Al质量分数（周媛等，2011）。

1.5 不同玉米品种根系分泌异羟肟酸类物质的收集与分析

按“1.2”的方法培养，将10 d苗龄的幼苗根系分别浸入至含0、10 µmol·L-1AlCl3的0.5 mmol·L-1CaCl2溶液中（pH 4.5）。24 h后收集含根系分泌物的全部培养液，以蒸馏水定容到1.00 L。搅拌均匀后取其中500 mL，于40 ℃水浴中减压旋转蒸发至干燥。浓缩瓶中分泌物以0.5 mL甲醇（80%）溶解。溶出物于10000 r·min-1的转速下离心10 min。上清液以微孔滤膜（<0.45 μm）过滤。-20 ℃冰箱储存备用。异羟肟酸类物质采用 HPLC分析，分析柱为Waters XTerra TMRP C18柱，柱温30 ℃，流动相为 V(甲醇)∶V(pH 2.6的冰醋酸溶液)=0.28∶0.72，流速1 mL·min-1，检测器为紫外检测器，波长280 nm。

2 结果与分析

2.1 玉米耐铝性的基因型差异

在铝胁迫下，根伸长率、根尖胼胝质和铝质量分数是评价植物耐铝性的重要指标。在 10 μmol·L-1AlCl3处理后（表1），56个品种玉米幼根伸长量均有不同程度降低，平均值相当于对照（0 μmol·L-1AlCl3）的69.33%。然而，铝胁迫下玉米不同品种根伸长量差异极显著（P<0.01），变异在94.75%～49.28%之间，变异系数达18.07%。铝胁迫下相对伸长率较高的品种有泰玉11号、费玉3号、正大99A12、农大108、花单一号和隆玉602等，特别低的品种有郑单958、金玉6号、广糯一号、黄金糯一号、京科糯123、紫糯一号和迪卡008等。

在10 μmol·L-1AlCl3处理后根尖中积累一定量的铝，平均增加值达4.52 μg·g-1（图1）。铝处理后玉米根尖中铝质量分数有显著差异（P<0.05），不同品种中的铝质量分数增加变幅达0.76～8.81 μg·g-1，变异系数为18.07%。根尖铝质量分数增加较小的品种为泰玉11号、费玉3号、正大619、豫玉18和花单一号，而根尖铝质量分数增加较多的品种有郑单958、京科糯123、垦粘一号、303香甜糯和黄金糯一号。

图1 玉米根尖铝质量分数(n=15)Fig. 1 Al content in root tips of maize varieties(n=15)

图2 玉米根尖胼胝质质量分数(n=15)Fig. 2 Callose content in root tips of maize varieties(n=15)

AlCl3处理后根尖中胼胝质质量分数有不同程度增加（图2）。处理后根尖中胼胝质质量分数较对照平均高8.99 μg·g-1。根尖中胼胝质质量分数也有显著差异（P<0.05），不同品种中胼胝质质量分数变异范围达4.20～17.89 μg·g-1，变异系数为26.24%。铝对根尖胼胝质质量分数的影响较小的品种有郝育21、泰玉11号、费玉3号、农大108、桂玉609和京紫糯 218，而根尖胼胝质质量分数增加较多的品种有郑单958、正大99A12、金玉6号、京科糯123和广糯一号。

图3 不同玉米品种的聚类分析Fig. 3 The clustering dendrogram of maize varieties

以铝胁迫下根相对伸长率、根尖铝和胼胝质质量分数为参数，采用欧式距离平均法对供试材料进行聚类分析（图3）。在欧式距离 15.0处，将56个玉米品种分为A、B、C等3大类。A类包括3个亚类（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）共 30个品种。该类玉米品种在铝胁迫下相对根伸长率高，根尖铝质量分数和胼胝质质量分数低，故为耐铝型，其中泰玉11号、正大99A12和费玉3号，耐铝性表现突出。B类包括 19个品种。在铝胁迫下，该类玉米品种相对根伸长率较低、根尖铝质量分数和胼胝质质量分数较高，划分为中间型。C类包含2个亚类（Ⅳ和Ⅴ）7个品种。在铝胁迫下，该类玉米品种相对根伸长率最低，根尖铝质量分数和胼胝质质量分数高，故划分为铝敏感性，其中郑单958、京科糯123、金玉6号和迪卡008最为敏感。

2.2 铝胁迫下玉米根系分泌的异羟肟酸

由图4可见，铝可诱导玉米根系分泌异羟肟酸，但不同品种的分泌量有明显差异。不同品种玉米在10 μmol·L-1AlCl3处理后根系增加分泌丁布量的变化范围在-3.63～89.24 μg·g-1之间。铝胁迫下，泰玉11号、费玉3号、豫玉18、晋单51、农大108、花单一号、正大99A12等品种根系分泌增加的丁布较多，均在50 μg·g-1以上。相反，郑单958、金科糯123、金玉6号、紫糯一号、迪卡008等品种不分泌或分泌较少。供试品种中，丁布分泌量最高的品种是正大619和泰玉11号，最低的品种是郝育21，前者大约是后者的4倍。门布分泌量最高的品种是泰玉11号、费玉3号、琛玉201，最低的品种为郝育21，分泌量仅为0.35 μg·g-1，前者大约是后者的150倍。

10 μmol·L-1AlCl3处理后根系分泌的门布也增加，分泌增加量变化范围在-6.57～120.49 μg·g-1之间（图5）。分泌质量分数较高的品种为泰玉11号、费玉3号、琛玉201、苏玉10号、农大108、正大99A12等，而分泌质量分数较低的品种为正大619、甜宝2000、垦粘一号、紫糯一号、玉美头601等。

图4 玉米根尖丁布质量分数(n=15)Fig. 4 DIMBOA content in root tips of maize varieties(n=15)

图5 玉米根尖门布质量分数(n=15)Fig. 5 MBOA content in root tips of maize varieties(n=15)

丁布和门布的分泌总量在不同玉米品种中也存在着差异，最高的品种是泰玉 11号，最低品种是郝育21，前者大约是后者的8倍。两者分泌量都较高的品种为泰玉11号。

表2 玉米根各指标间的相关系数Table 2 Correlation coefficients between various indexes of maize root

2.3 根系分泌异羟肟酸与玉米耐铝的相关性

玉米异羟肟酸分泌与耐铝参数的相关分析结果（表2）表明，10 μmol·L-1AlCl3处理下的玉米根系丁布和门布分泌量与根相对伸长率的相关系数分别为r=0.4550**和r=0.6008**，均达到极显著正相关水平。相反，根系丁布和门布分泌量与根尖铝质量分数间呈极显著负相关，相关系数分别为r＝-0.3542**和r＝-0.4841**。这些结果说明，根系分泌的异羟肟酸可能减少铝在根尖的积累并提高玉米对铝毒的抵抗能力。

3 讨论与结论

3.1 讨论

铝毒被认为是酸性土壤中限制作物生长最重要的因素，严重影响酸性土壤上作物的生产力，但由于生长环境的差异，植物进化出不同的策略来抵抗铝毒害，其中铝诱导根系分泌有机酸（如柠檬酸、苹果酸、草酸等）将根际土壤中铝螯合成无毒的铝-有机酸复合物从而起到解除或缓解铝毒是植物最为重要的抗铝机制（Ryan等，2009；左方华等，2010；Li等，2009；Kochina等，2015）。有机酸分泌在玉米抗铝作用的研究已较深入，科研工作者已鉴定和克隆得到编码有机酸分泌通道的基因（Yang等，2006；Maron等，2013；Ligaba等，2012）。但也有研究表明类黄酮类酚醛的分泌似乎能减轻铝对玉米的毒害（Tolra等，2009；Kidd等，2001）。而玉米体内的异羟肟酸类物质的结构与黄酮类酚醛的结构相似，其质量分数也普遍较高。异羟肟酸对离子的亲合力很强，能与铝络合形成异羟肟酸-铝络合物，并且这些络合物的形成可以减轻铝对微生物的毒害（Rogers等，2001；Rosenberg和Maurice，2003；Moore等，2003）。同时，玉米体内的异羟肟酸质量分数也存在明显的基因型差异，且体内的异羟肟酸可以减弱铝对玉米的伤害并提高玉米的抗性。本研究发现，铝可诱导玉米根系分泌异羟肟酸类物质。在铝胁迫下不同玉米品种根系异羟肟酸类物质分泌量差异显著，耐铝能力强的品种根系异羟肟酸类物质分泌量显著高于铝敏感品种（图 4、图5）。并且，铝诱导根系丁布和门布分泌量与根相对伸长率之间呈极显著正相关（r=0.4550**、r=0.6008**，表2），而与根尖铝质量分数呈极显著负相关（r=-0.3542**、r=-0.4841**，表2）。聚类分析标目耐铝型品种根系异羟肟酸的分泌也高于铝敏感性品种（图3、图4、图5）。另一方面，耐铝型品种根尖铝质量分数显著低于铝敏感型品种，且根尖铝质量分数与丁布和门布的分泌量呈显著的负相关关系。这些结果说明，铝诱导根系分泌异羟肟酸类物质可能是玉米抵御铝毒的一种新机制。

3.2 结论

（1）10 μmol·L-1AlCl3处理24 h后，56个供试玉米品种的根伸长率、根尖胼胝质积累增加量和铝质量分数增加量分别变化在 94.75%～49.28%、4.20～17.89 μg·g-1、0.76～8.81 μg·g-1之间，变异系数分别达到 18.07%、26.24%、46.09%。这些结果表明，玉米的耐铝性存在着明显的基因型差异。聚类分析结果，56个玉米品种可分为耐铝型、铝敏感型、中间型。供试的品种多为耐铝型，达 30个品种，比例达53.6%。泰玉11号、正大99A12和费玉3号等属于耐铝型品种。铝敏感型品种较少，包括郑单958、京科糯123、金玉6号和迪卡008等7个品种。中间型品种也较多，达到19个。

（2）铝胁迫显著抑制了玉米根的伸长，不同玉米品种之间对铝的耐受程度存在显著差异。在铝胁迫下，根尖胼胝质质量分数和铝质量分数增加。同时根的相对伸长率与根尖铝质量分数之间呈极显著负相关（r=-0.9104**），与胼胝质质量分数间也呈极显著负相关（r=-0.3567**），根尖铝质量分数与胼胝质质量分数呈显著正相关（r=0.3095*）。

（3）铝可诱导玉米根系分泌异羟肟酸类物质。在铝胁迫下，不同玉米品种根系异羟肟酸类物质分泌量差异显著，耐铝能力强的品种根系异羟肟酸类物质分泌量显著高于铝敏感品种。并且，铝诱导根系丁布和门布分泌量与根相对伸长率间呈极显著正相关（r=0.4550**、r=0.6008**），而与根尖铝质量分数呈极显著负相关（r=-0.3542**、r=-0.4841**）。聚类分析为耐铝型的品种，根系异羟肟酸的分泌也高于铝敏感性品种。这些结果说明，铝诱导根系分泌异羟肟酸类物质可能是玉米抵御铝毒的一种有效机制。

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The Relationship between Hydroxamates Cyclic Secretion from Maize and Its Tolerance to Aluminum

TANG Xinlian, GUO Tianxiang, GAO Xiaofeng, LI Xiaofeng, GU Minghua
Faculty of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530004, China

Aluminum (Al) toxicity is a major limiting factor for plant growth on acid soils; plants have evolved different strategies to detoxify Al stress due to different growth environments. Elucidation of these strategies will help us generate crops with enhanced Al tolerance. Most land plants use secretion of organic acid anions, such as oxalate, citrate and malate in response to Al stress. However, little work has so far been reported on relationship between Al resistance and Al-induced exudation of hydroxamates cyclic from roots of Zea Mays L. varieties. In this study, fifty-six varieties of maize were used to study the relationship between hydroxamates cyclic and Al tolerance based on the root elongation, Al content, callose content and hydroxamates cyclic measured among these 56 varieties. Al could induce secretion of hydroxamates cyclic from roots of different maize varieties, and callose, Al content of root tips were also significantly increased after Al treatment. Furthermore, there was significantly positive correlation between the root elongation and Al-induced secretion of hydroxamates cyclic(rDIMBOA=0.455 0**, rMBOA=0.600 8**)，whereas there was significantly negative correlation between the Al content and hydroxamates cyclic(rDIMBOA=-0.354 2**, rMBOA=-0.484 1**), and callose was also significantly positively related to hydroxamates cyclic (rDIMBOA=-0.365 1**, rMBOA=-0.135 1). Cluster analysis showed that Al-induced secretion of hydroxamates cyclic from 30 Al-tolerance varieties such as Taiyu No.11, Feiyu No.3 and so on were higher than those of 7 Al-sensitive varieties such as Zhengdan No.958, Beiyu No.2883 and so on. Our results suggested that the secretion of hydroxamates cyclic in roots could be a novel mechanism for some tolerance varieties to resist the toxicity of Al.

maize; aluminum; hydroxamates cyclic; correlation analyses

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.04.001

Q948.113

A

1674-5906（2015）04-0547-07

唐新莲，郭添香，高小凤，黎晓峰，顾明华. 玉米异羟肟酸类物质的分泌与其耐铝性的关系[J]. 生态环境学报, 2015, 24(4): 547-553.

TANG Xinlian, GUO Tianxiang, GAO Xiaofeng, LI Xiaofeng, GU Minghua. The Relationship between Hydroxamates Cyclic Secretion from Maize and Its Tolerance to Aluminum [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(4): 547-553.

国家自然科学基金项目（31201680）；广西自然科学基金项目（2012GXNSFAA053047）

唐新莲（1972年生），女，副教授，博士，主要从事植物营养与环境生态领域的研究工作。E-mail: txl@gxu.edu.cn

2015-02-08