胶质瘤干祖细胞分化与自噬的相关性研究＊

魏子龙，赵耀东，黄 强，任 力△，沙龙贵

1.上海市浦东医院 神经外科（上海 201300）；2.上海市第一人民医院 神经外科（上海 200080）；3.苏州大学附属第二医院 神经外科（苏州 215004）

肿瘤干细胞理论认为，肿瘤是由肿瘤中为数不多的肿瘤干细胞增殖、发育所致。胶质瘤干祖细胞（GSPCs）又称胶质瘤始动细胞，在体内外均具有无限增殖能力［1］。神经干细胞（NSCs）能自发且完全分化为胶质细胞及神经元，而GSPCs不能，甚至在诱导分化过程中出现可逆分化［2］。目前，关于NSCs与GSPCs分化差异及分子机制的研究多见，而GSPCs分化与自噬关系的研究少见。自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，通过与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，以此实现某些细胞器的更新与细胞本身的代谢需要［3］。研究［4－5］表明，细胞分化及发育与自噬具有一定相关性。本实验通过观察GSPCs诱导分化前后自噬活性的变化，探讨GSPCs分化与自噬的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 GSPCs株由苏州大学附属第二医院神经外科黄强教授实验室建立，长期体外传代并由该实验室保存。GSPCs取自新鲜胶质瘤手术标本（52岁女性患者自愿捐赠），经分离、体外培养、鉴定及扩增保存。

1.1.2 试剂与仪器 1）主要试剂：DMEM/F12无血清培养基（体积比1∶1），1/100N2添加剂和20 ng/mL（终浓度）碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，美国Gibco公司），20ng/mL（终浓度）表皮生长因子（EGF，美国Invitrogen公司），微管相关蛋白轻链3（LC3）抗体（美国 MBL公司），beclin－1抗体（美国Santa Cruze公司），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、微管相关蛋白－2（MAP－2）抗体及β－actin抗体（德国Sigma公司），免疫组织化学试剂盒［含辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（或羊抗鼠）IgG二抗（1∶2 500）］及DAB显色试剂盒（上海科兴生物公司），3－甲基腺嘌呤（3－MA，德国Sigma公司），BCA 蛋白定量试剂盒（美国Piece公司），雷帕霉素（RPM，上海齐奥化工科技有限公司）；2）主要实验仪器：SDSPAGE凝胶电泳仪（美国Bio－Rad公司），精确度为1μm的Nikon Eclipse TE2000－U型倒置荧光显微镜（日本Nikon公司），精确度为0.1μm 的TCSSP2型共聚焦显微镜（德国Leica公司），点分辨精确度为0.24nm、线分辨精确度为0.10nm 的JEOL－1230型透射电子显微镜（日本电子株式会社）。

1.2 方法

1.2.1 GSPCs自噬活性检测 将GSPCs分为两组，分别培养于干细胞培养基和诱导分化培养基（含10%胎牛血清的DMEM/F12）中，隔天更换1次培养基，7d后终止培养。取两组细胞用于免疫染色、透射电镜标本制备及Western blot检测，实验重复3次。

1.2.2 GSPCs诱导分化 GSPCs培养于诱导分化的培养基（含10%胎牛血清的DMEM/F12）中，并分为两组。实验组加入终浓度为0.01mmol/L的自噬抑制剂3－MA；对照组不添加，培养基隔天更换1次，7d后终止培养。随机选取3个视野，每个视野至少包含100个细胞，细胞分化比例根据倒置相差显微镜下细胞突起伸长情况进行计算，以（±s，n＝3）表示。同时行免疫染色，并检测GFAP、MAP－2、beclin－1表达，实验重复3次。

1.2.3 GSPCs未诱导和诱导分化下自噬激活剂RPM的使用 无血清条件下培养部分GSPCs，加入不同浓度RPM（0.2μg/mL～12.5ng/mL），24、48h后观察细胞形态的变化，并比较与未加RPM组细胞形态的异同；另一部分培养于含3%胎牛血清DMEM/F12的GSPCs，加入0.2μg/mL～12.5 ng/mL不同浓度RPM，24h后观察细胞形态的变化，并与未加RPM组比较细胞形态的异同。随机选取3个视野，每个视野至少包含100个细胞，细胞分化比例＝倒置相差显微镜下有细胞突起的细胞/该视野下的细胞总数（包括有突起的细胞和无突起的细胞）×100%，以（±s，n＝3）表示。

1.2.4 免疫细胞化学法检测LC3表达 诱导分化后，将种植于预铺多聚赖氨酸玻片上的GSPCs，在分化培养基中继续培养2h，固定于玻片表面后弃除培养基，PBS冲洗两次，5min/次；按1∶1比例（甲醇/乙醇）配制固定液，固定20min，PBS冲洗两次，5min/次，采用0.1%Triton－X100孵育10min后，再用PBS冲洗两次，5min/次；采用1%BSA封闭液孵育1h，PBS冲洗两次，5min/次；加入适量一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，5min/次；加入Cy3耦联二抗，避光孵育2h，PBS冲洗3次，5min/次；0.5μg/mL DAPI孵育10min后梯度乙醇脱水，自然风干，于共聚焦显微镜下观察。

1.2.5 Western blot检测相关基因表达 GSPCs均以1mL PBS混匀，以离心半径5.5cm，转速2 000r/min，离心5min，弃上清，按1∶5比例加入聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）上样缓冲液混匀，煮沸10min，凝胶电泳；将分离胶上蛋白质转移至硝酸纤维（NC）膜，5%脱脂奶粉封闭1h后滴加一抗，37℃孵育1.5h，TBST缓冲液洗膜3次，5min/次；加入IgG二抗（1∶2 500）室温孵育1h，TBST缓冲液洗膜3次，5min/次，化学发光法显影。根据目的基因条带密度值，半定量计算相关基因表达丰度。

1.2.6 透射电镜标本制备 采用0.1mol/L戊二醛溶液将待测GSPCs 4℃固定2h，PBS冲洗，1%锇酸固定30min后梯度乙醇脱水，醋酸铀70%丙酮饱和溶液脱水过夜，环氧树脂包埋、固化，钻石刀切割制作组织切片，镍网收集后，柠檬酸铅染色8min后观察自噬小体。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计处理，定量资料比较采用t检验，以均数±标准差（±s）表示。检验水准α设定为0.05。

2 结果

2.1 GSPCs自噬活性检测结果

荧光显微镜显示，无血清干细胞培养基中生长的GSPCs内未见荧光强度高的斑点状结构（图1A）。GSPCs在含血清条件下培养7d后贴壁分化，细胞呈梭形或星形伸出突起样结构，显微镜下可见“突起”近端胞质区有小泡样结构，免疫染色示相应部位LC3呈点样分布（图1B）；透射电镜下可见GSPCs分化细胞内存在典型的自噬小体（图1C）。Western blot检测LC3发现，诱导分化后GSPCs中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ较分化前显著增加（图1D）。

图1 GSPCs自噬活性检测结果

2.2 3－MA对GSPCs诱导分化及自噬活性的作用

对照组贴壁分化为梭形或星形细胞（图2A），实验组贴壁减少（图2B），定量计数表明实验组分化比例显著低于对照组（图2C）。Western blot检测发现，实验组GFAP、MAP－2蛋白表达量均显著降低（图2D和图2E）。

Western blot检测发现，实验组beclin－1表达量显著低于对照组（图2F）。免疫细胞化学染色示，对照组胞浆内可见较多LC3阳性点状结构（图2G）；实验组罕见LC3阳性点状结构（图2H）。

图2 3－MA对GSPCs诱导分化及自噬活性的作用

2.3 自噬激活剂RPM对GSPCs分化状态的影响

RPM浓度及作用时间对无血清条件下培养的GSPCs形态学影响不明显，而12.5ng/mL RPM能显著增加含血清条件下培养的GSPCs贴壁分化细胞（图3）。

图3 自噬激活剂RPM对GSPCs分化状态的影响

3 讨论

肿瘤干细胞理论认为，肿瘤的生长及转移能力主要来源于肿瘤细胞中的一些细胞，即癌干细胞（CSCs）。目前，CSCs已在多种肿瘤组织中被证实。本研究亦从1例胶质瘤组织中成功获得GSPCs。一般而言，CSCs只能分化为具有亲本表型的癌细胞，而GSPCs只能分化为不成熟的神经元或胶质细胞。由于GSPCs具有自我更新及不能成熟分化的特征，导致肿瘤复发及对放化疗的阻抗［6］。研究已表明，自噬在多种细胞分化中具有重要作用［7－8］。LC3是自噬小体的特异性标志分子［9］，以LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ两种分子存在，且两者比例与自噬小体数量有关。本实验中在无血清干细胞培养基中生长的GSPCs，经免疫细胞化学法检测示LC3呈阴性，表明其自噬活性低。GSPCs在含血清条件下培养7d后贴壁分化，免疫细胞化学染色示LC3呈点样分布；透射电镜下可见GSPCs分化细胞内存在典型自噬小体；Western blot检测LC3发现，诱导分化后GSPCs中LC3－Ⅱ/LC3－Ⅰ较分化前显著增加，表明GSPCs自噬活性显著增加，提示GSPCs在未分化状态下自噬活性低，诱导分化后自噬活性显著增加。

GFAP和 MAP－2表达量越高，说明细胞分化越成熟。beclin－1是自噬所必须的抑癌基因［10］，其表达量降低提示自噬活性低下。本实验结果显示，实验组较对照组细胞贴壁减少，分化比例降低；免疫细胞化学染色示胞浆内罕见LC3阳性表达；Western blot检测证实，实验组GFAP、MAP－2及beclin－1表达量均显著降低，表明GSPCs诱导分化时，加入自噬抑制剂3－MA能抑制GSPCs诱导分化过程中原本增强的自噬活性，从而抑制GSPCs分化，提示自噬活性低可抑制GSPCs分化。此外，本实验还利用自噬激活剂RPM在无血清条件下作用于GSPCs，结果显示RPM浓度及作用时间对无血清条件下培养的GSPCs形态学无显著影响，与Zeng等［11］研究结果一致。GSPCs在含血清条件下培养时，适当浓度的RPM可促进其贴壁分化。为防止高浓度血清（10%）明显诱导GSPCs的分化，本实验将GSPCs培养于含3%胎牛血清的培养液中，24h后发现，在含3%胎牛血清条件下，无论是否有RPM，GSPCs均可贴壁分化，但RPM 存在时，GSPCs分化更明显，说明增强GSPCs自噬活性可提高其分化比例。

综上所述，GSPCs分化与其自噬活性密切相关。诱导分化后，GSPCs自噬活性增高，增强GSPCs自噬活性可促进分化，抑制其自噬活性可抑制分化，与Nabissi等［12］研究结果一致。

本研究提示，至少在部分肿瘤干细胞中自噬活性低下是其分化抑制的一种原因，这为抗肿瘤治疗提供了一种思路，在应用放化疗手段的同时可加用自噬活剂，通过增强其自噬活性而促进肿瘤细胞进一步分化成熟，减轻其恶性程度及对放化疗的阻抗，从而提高肿瘤治疗的疗效。

［1］Wang Z，Fei X，Dai X，et al.Differentiation of glioma stem cells and progenitor cells into local host cell－like cells：a study based on choroidcarcinoma differentiation of choroid plexus of GFP transgenic nude mouse［J］.Cancer Biother Radiopharm，2015，30（5）：225－232.

［2］Yamamuro S，Okamoto Y，Sano E，et al.Characterization of glioma stem－like cells from human glioblastomas［J］.Int J Oncol，2015，47（1）：91－96.

［3］Calabrese C，Poppleton H，Kocak M，et al.A perivascular niche for brain tumor stem cells［J］.Cancer Cell，2007，11（1）：69－82.

［4］Yuan J，Yu M，Li HH，et al.Autophagy contributes to IL－17－induced plasma cell differentiation in experimental autoimmune myocarditis［J］.Int Immunopharmacol，2014，18（1）：98－105.

［5］Orfali N，O′Donovan TR，Nyhan MJ，et al.Induction of autophagy is a key component of all－trans－retinoic acidinduced differentiation in leukemia cells and a potential target for pharmacologic modulation［J］.Exp Hematol，2015，43（9）：781－793.

［6］龚海东，张哲男，胡永珍，等.miR－155与胶质瘤的研究进展［J］.现代生物医学进展，2013，13（35）：6994－6997.

［7］蒋卉男，胡荣，刘卓刚，等.自噬与白血病治疗研究最新进展［J］.中国实验血液学杂志，2015，23（1）：290－294.

［8］朱朋飞，秦建民.细胞自噬在原发性肝癌发生与防治中的生物学作用［J］.中国医药科学，2015，5（4）：24－28.

［9］Kanzawa T，Germano IM，Komata T，et al.Role of autophagy in temozolomide－induced cytotoxicity for malignant glioma cells［J］.Cell Death Differ，2004，11（4）：448－457.

［10］Wang RC，Wei Y，An Z，et al.Akt－mediated regulation of autophagy and tumorigenesis through beclin 1 phosphorylation［J］.Science，2012，338（6109）：956－959.

［11］Zeng M，Zhou JN.Roles of autophagy and mTOR signaling in neuronal differentiation of mouse neuroblastoma cells［J］.Cell Signal，2008，20（4）：659－665.

［12］Nabissi M，Morelli MB，Amantini C，et al.Cannabidiol stimulates Aml－1a－dependent glial differentiation and inhibits glioma stem－like cells proliferation by inducing autophagy in a TRPV2－dependent manner［J］.Int J Cancer，2015，137（8）：1855－1869.