蛋白质精氨酸甲基转移酶6调控前列腺癌发生的分子机制＊

徐 莹，阎 英，柳云恩

1.沈阳军区总医院 放射治疗科（沈阳 110840）；2.沈阳军区总医院 急诊医学部，全军重症战创伤救治中心实验室（沈阳 110840）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是世界常见恶性肿瘤之一，多见于欧美等国家［1－2］。雄激素受体（androgen receptor，AR）作为核受体超家族蛋白成员，是一种配体依赖的转录因子，其结构主要包括转录激活功能域 1（activation function 1，AF－1）及AF－2。AF－1不依赖于配体的结合，AF－2需要同源配体结合，通过招募大多数的 AR辅助因子［3－4］，参与蛋白质和蛋白质间的相互作用。当AR与配体（如雄激素）结合后，AR与其分子伴侣解离，从细胞质转运至细胞核，同时招募特定的转录辅助调节因子形成复合物［5］，结合到靶基因的反应元件上，通过改变染色体结构调节基因转录［6－7］。 研究［8－9］发现，AR在PCa的发生发展中发挥着至关重要的作用，它通过调控AR下游PCa相关基因的转录，促进PCa的发生发展。迄今为止，研究发现大量的AR辅助调控因子，如 p68［10］、LSD1［11］、RNF6［12］、ARD1［13］、JARID1B［14］和 FLH2［15］等，在 PCa中过表达，并促进癌症细胞的增殖。因此，研究AR活性调控的分子机制对于PCa的治疗具有重要意义。

蛋白质精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）家族具有催化精氨酸甲基化的作用，其功能取决于底物特异性及其亚细胞定位［16］。PRMTs根据其催化甲基化的类型可以分为3类，蛋白质精氨酸甲基转移酶6（protein arginine methyltransferase 6，PRMT6）属于Ⅰ类，催化酶胍基氮的精氨酸残基甲基化［17－18］。研究［19］发现，PRMT6可以抑制肿瘤抑制基因p53的转录表达。细胞周期蛋白依赖性激酶（the cyclindependent kinase，CDK）的抑制基因 p21 是PRMT6重要的直接下游靶基因，通过抑制p21从而促进细胞增殖和抑制细胞衰老。PRMT6基因敲除可以使细胞周期停滞，提示PRMT6在细胞周期调控中也起重要作用［20］。p21是多种肿瘤抑制基因和癌基因的下游基因，它参与了乳腺癌［21－22］、骨肉瘤［18］和肝癌［23］等肿瘤的发生发展。

目前，PRMT6是AR的一种辅助激活因子，它不仅可以激活正常表达的AR，也可以显著激活突变的AR。PRMT6的类固醇受体基序可以与AR的AF－2相互作用，从而起到激活作用［24］。然而，PRMT6调控PCa发生发展的分子机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨PRMT6在PCa细胞中的作用及调控机制，为PCa的诊断及治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 前列腺增生（BPH）和PCa的免疫组织化学分析

福尔马林固定石蜡包埋的BPH和PCa的病理切片来源于沈阳军区总医院。数据采集及组织应用研究通过人体伦理研究委员会批准。实验共有100例组织，其中BPH标本50例，PCa组织标本50例。对所有组织行免疫组织化学染色，检测标本PRMT6的表达水平。抗鼠的多克隆抗体PRMT6（santa，sc－271744，1∶100）、亲和素生物素标记的第2抗体及碱性磷酸酶标记的链霉素工作液孵育，DAB显色后，核用苏木精复染。

1.2 细胞培养

CWR22Rv1、LNCaP、DU145和 VCaP细胞（购自沈阳汇佰生物科技有限公司）维持在RPMI1640（GIBCO－BRL）培养基中。PC3细胞维持在F12培养基中。所有细胞培养基含有10%胎牛血清（FBS）、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL链霉素和青霉素。细胞于37℃，5%CO2培养箱培养。

1.3 质粒、siRNA转染

PRMT6（ID：55170）表达质粒及siRNA由沈阳汇佰生物科技有限公司制作，体外转染CWR22Rv1和LNCaP细胞利用LipofectamineTM 2000（Invitrogen）试剂盒，具体步骤请参照试剂说明书。

1.4 Real Time PCR

总RNA 提取应用Trizol试剂（Invitrogen）。反转录使用Super－ScriptⅡ（Invitrogen），cDNAs通过Real Time PCR量化使用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）和 aMx3000Pinstrument（Agilent StrataGene）仪器。PSA和KLKZ基因表达分析采用Stratagene Mx3000P软件。

1.5 Western blot检测

实验蛋白样品加入相应比例的SDS凝胶上样缓冲液（6×Loading Buffer），煮沸变性5min，SDSPAGE电泳，转膜，然后将膜移至5% 的脱脂奶粉PBST缓冲液室温封闭1h，PBST洗膜3次。加入一抗 PRMT6（santa，sc－271744，1∶2 000）和 GAPDH（santa，sc－365062，1∶4 000），4 ℃ 孵育过夜。用PBST洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗，室温孵育1h。洗膜3次，ECL显影。

1.6 绘制细胞生长曲线和细胞增殖

分别接种22Rv1和LNCaP于12孔板中，每孔约5万个细胞分别转染siPRMT6及对照siRNA，DHT处理及不处理。于0、24、48、72、96、120h时进行细胞计数，绘制细胞生长曲线。分别接种22Rv1和LNCaP于6孔板中，每孔约5万个细胞分别转染siPRMT6及对照siRNA，DHT处理及不处理后5d，多聚甲醛固定，锥虫蓝染色，照相。

1.7 Transwell小室培养

22Rv1和LNCaP细胞分别转染siPRMT6及对照siRNA后，撤血清饥饿12～24h。接种5万个细胞于Transwell小室。加入500μL含FBS或趋化因子的培养基。培养48h后，95%乙醇固定10 min，锥虫蓝染色，棉签擦去小室上室内多余的细胞，照相。

1.8 流式细胞技术

22Rv1和LNCaP分别转染siPRMT6及对照siRNA，DHT处理及不处理24h后，胰酶消化，制成单细胞悬液，75%乙醇固定，IP染液染色，37℃孵育1h，上机检测。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，根据资料的分布特征，分别选择χ2检验、mann－whitney U和方差分析方法进行比较，所有统计检验均为双侧概率检验。检验水准α设定为0.05。

2 结果

2.1 PRMT6在PCa中高表达

结果发现，PRMT6在PCa中高表达，而在BPH中表达较低，对PRMT6的表达情况评分并进行统计学分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，采用Western blot检测PRMT6在5种PCa细胞系中的表达，结果发现，PRMT6均有表达（图1）。

图1 PRMT6在PCa中高表达

2.2 PRMT6促进AR下游靶基因PSA和KLK2的转录

本研究定制了1种PRMT6的表达质粒及3种PRMT6的siRNA，结果发现，PRMT6过表达促进PSA和KLK2的转录，而敲除PRMT6后PSA和KLK2的转录水平降低（图2）。

图2 PRMT6促进AR下游靶基因PSA和KLK2的转录

2.3 PRMT6促进PCa细胞的增殖

结果发现，与对照组相比，PRMT6基因敲除可显著减少PCa22Rv1和LNCaP细胞增殖。同时，通过将PRMT6基因敲除后分别转染到22Rv1和LNCaP细胞后，发现PRMT6基因敲除明显抑制细胞的增殖（图3）。

2.4 PRMT6促进PCa细胞周期的进程

利用流式细胞技术研究PRMT6对PCa细胞周期的影响，结果显示，敲除PRMT6后22Rv1和LNCaP细胞停滞在G1期的细胞明显增多（图4）。

2.5 PRMT6促进PCa细胞的迁移

通过Transwell小室实验研究PRMT6对PCa细胞迁移的影响，结果发现，敲除PRMT6后，22Rv1和LNCaP细胞的迁移率降低（图5）。

图3 PRMT6促进PCa细胞的增殖

图4 PRMT6促进PCa细胞周期的进程

图5 PRMT6促进PCa细胞的迁移

3 讨论

PCa是欧美国家常见的恶性肿瘤之一，是男性致死的第2大癌症。中国PCa的发病率较低，但近年来有逐渐上升的趋势［25－26］。目前，PCa的治疗方法主要以内分泌治疗为主，但大多仅在早期有效，最终发展成趋势抵抗的PCa，难以治愈［27］。本研究发现，PRMT6在PCa中高表达，它通过促进AR下游靶基因PSA和KLK2的转录，调控PCa的进程。此外，PRMT6还促进PCa细胞增殖，加快细胞周期的进程和促进肿瘤细胞的迁移。

本研究通过免疫组织化学检测BPH和PCa患者的病理石蜡切片，发现PCa组织中PRMT6的表达水平明显高于BPH，同时通过Western blot技术检测5种PCa细胞系中PRMT6的表达情况，发现PRMT6在5种细胞系中均有表达，结果提示PRMT6在PCa中呈高表达。研究［24］证 实，PRMT6在多种癌症中具有生理功能，它是AR的一种辅助激活因子，可以与ARAF－2相互作用，激活AR。研究［28］发现，PCa组织中PRMT6表达水平显著高于正常的前列腺组织，它能较好地区分正常组织和肿瘤组织，本研究结果与其相似。结果提示，PRMT6作为AR的一种辅助激活因子，可能在PCa的发生发展进程中发挥着重要调控作用。然而，PRMT6调控PCa发生发展的分子机制，目前尚不清楚。

PCa发生发展与AR密切相关，AR是核受体超家族蛋白的成员之一，它在前列腺生长发育及生理功能方面起重要作用。AR表达和转录调控受其转录辅助调控因子的调节，一旦AR的转录辅助调控因子发生改变，会引起AR及其下游靶基因的表达异常，导致PCa和雄激素不敏感症等AR相关疾病。PRMT6是正常和突变AR的特异性辅助激活因子，其与AR相互作用在AR突变时显著增强，通过PRMT6类固醇受体相互作用区域LXXLL和AR激活功能2。AR的转录激活需要PRMT6的催化活性和Akt结构域精氨酸残基的甲基化参与［24］。本研究选取AR阳性激素非依赖的22Rv1细胞和AR阳性激素依赖的LNCaP细胞进行研究。通过将过表达及敲除PRMT6的siRNA转染至22Rv1和LNCaP细胞中，采用Real Time PCR研究PRMT6表达改变对AR下游促癌基因PSA和KLK2的转录影响，结果发现，PRMT6可以促进PSA和KLK2的转录，提示PRMT6可能通过调控AR下游靶基因的转录，从而促进PCa的发生发展。

本研究通过绘制细胞生长曲线、克隆实验、流式细胞技术和Transwell实验，研究PRMT6对22Rv1和LNCaP细胞增殖、细胞周期及迁移的影响，结果发现，PRMT6可以促进22Rv1和LNCaP的细胞增殖，调控细胞周期的进程，敲除PRMT6后细胞周期进程中主要作用于G1期，同时PRMT6可以促进22Rv1和LNCaP的迁移。研究［29］发现，p21是一种强效的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，在促进G1细胞周期阻滞和细胞衰老方面发挥重要作用。p21是多种肿瘤抑制基因和癌基因的下游靶基因，它在大多数的肿瘤包括乳腺癌中表达下调。PRMT6作为一种已知的转录辅助因子直接抑制p21启动子。PRMT6基因敲除导致乳腺癌细胞中p21抑制，同时导致细胞周期阻滞和细胞衰老。结果提示，PRMT6作为乳腺癌细胞中癌基因，因具有促进细胞生长和抑制衰老的特点，可以作为肿瘤治疗的潜在靶点。PELP1与PRMT6相互作用，并改变PRMT6的功能，抑制PRMT6，可以减轻PELP1介导的雌激素受体激活、细胞增殖和集落形成。PELP1与PRMT6被募集作为雌激素受体的靶基因，协同调节参与肿瘤形成的基因选择性剪接，结果提示，PELP1－PRMT6轴可能是乳腺癌治疗的潜在靶点。此外，研究［30］发现，PRMT6过表达抵消由野生型p16诱导的人肺腺癌细胞A549细胞周期阻滞在G1期，同时过表达的PRMT6能够与p16相互作用，导致p16－CDK4关联强度降低。此前文献［31］报道，在PRMT6过表达的乳腺癌 MCF7细胞系中，细胞生长率和集落形成能力明显滞后于正常对照组细胞，血小板反应蛋白－1（TSP－1）是一种有效天然的血管生成抑制剂，它在PRMT6过表达的乳腺癌细胞中明显上调，由PRMT6过表达导致的转移和侵袭的抑制可以通过特异性敲除TSP－1基因缓解，结果提示，PRMT6过表达与肿瘤细胞的运动和侵袭调节相关。

总之，PRMT6在PCa中高度表达并通过调节AR下游靶基因的表达促进PCa的发生发展，同时PRMT6可调控PCa细胞的细胞周期，促进细胞的增殖及迁移。

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