FOXO3a基因联合干细胞修复化疗对卵巢早衰的作用及分子机制

广东省广州市荔湾区第二人民医院(510160)房丽红

卵巢早衰(POF)是指女性在45岁以前出现持续性闭经4个月或以上、性器官萎缩，伴有促性腺激素包括卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH)升高，而雌激素降低的综合征［1］。卵泡期血液检查不少于2次(间隔不少于30天)显示血清卵泡刺激素(FSH)＞40 U/L、雌二醇(E2)＞73.2 pmol/L。在国外，普通人群POF发病率约为1.0%［2］，中国约3.8%，其中特发性POF约占80.0%。卵巢中干细胞的发现尤其是生殖干细胞的发现为延缓衰老及POF的治疗提供了良好的前景，干细胞治疗在动物试验方面取得的成果为POF患者卵巢功能及生育能力的恢复带来了希望。Forkhead Box(Fox)转录因子家族在胚胎发育过程中起着关键性的调控作用。这些基因表达的改变与动物的生长发育、免疫调控以及肿瘤的发生密切相关，它的突变也可引起卵巢生理功能的改变、POF和卵巢肿瘤的发生。干细胞DNA修复与FOXO3a通路密切相关。FOXO3a可促进干细胞的增值即有助于维持干细胞的功能［3-4］。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 临床标本 93例标本取自我院2012年10月至2014年3月，妇科POF干细胞修复化疗患者93例，其中青年组(＜25岁)63例;中年组(35～45岁)30例。所有患者无慢性疾病史。

1.1.2 试剂 PCR试剂盒(Invitrogen)公司，RevertAidTM First strand cDNAsynthesis Kit Fermentas公司，Trizol试剂(Invitrogen)公司，SYBR Green PCR premix大连宝生物公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 所有用品均严格按消除RNase的常规方法处理，玻璃及金属器皿在250℃烘烤4小时，塑料器皿用DEPC溶液浸泡24小时，高压灭活DEPC后烤干备用。将患者卵巢组织从液氮中取出，在无菌的研钵中加液氮进行研磨成粉末状，放入加有1mLTrizol的Ep管(每100 mg组织)，4℃离心，12000rmp/min，5分钟，留上清，每管加入200μL异丙醇以抽提蛋白，4℃离心，12000 rmp/min，15分钟，弃上清，每管加1mL无水乙醇，离心10分钟，每管加3～40μL DEPC水，混匀，测RNA浓度。各样本OD260/OD280比值均在1.8～2.0，说明提取的RNA较纯。

1.2.2 反转录合成cDNA 用反转录试剂盒反转RNA为cDNA。具体操作步骤同说明书。

1.2.3 实时荧光定量PCR 从GeneBank中检索小鼠FoxO3a和β-actin基因引物序列，在线Genbank查找目的基因FoxO3a和β-actin cDNA序列，应用DNA MAN软件设计引物，引物的详细资料见表1，引物由上海生工生物公司合成。2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL，反转录cDNA2μL，上游引物0.3μL(10μM，下游引物0.3μL(10μM)，ddH2O 7.4μL，总体积20μL。标准品，分别以10为系数进行倍比稀释，分别制备目的基因和内参基因标准曲线。反应体系:FOXO3a进行实时荧光定量PCR反应参数为预变性95℃30秒钟，95℃15秒钟，60℃30秒钟，β-actin进行实时荧光定量PCR反应参数为预变性95℃30秒钟，95℃15秒钟，58℃30秒钟，荧光检测，反应45个循环，每个样设3个复孔。采用2-ΔΔCt法，确定特定荧光域值对应循环数的Ct值，对目标基因定量。

表1 定量RT-PCR所用的基因引物

1.2.4 统计分析方法 采用SPSS17.0软件进行统计学处理，实验数据以()表示，采用单因素方差分析和多重比较对各组进行比较分析，以P＜0.05差异有显著性。

2 结果

POF患者卵巢组织FOXO3amRNA的表达变化实时荧光定量结果显示，组间比较，中年组FoxRNA高于表年组。组内比较治疗后青年组中器质性病变的患者与功能性病变的患者卵巢中FOXO3a mRNA均明显升高，差异具有显著性(P＜0.05)，其中器质性病变FOXO3a mRNA水平低于功能性病变的患者。

3 讨论

POF主要分为器质性病变和功能性病变，器质性病变涉及肿瘤发生等改变，遗传基因改变是皮肤自然衰老的根本，有研究表明，FOXO3a基因能抑制卵泡活化，防止POF［5-8］。

如果用于治疗的胚胎干细胞具有其特有的多能性和全能性，胚胎干细胞无论对转基因动物的制备还是对疾病的治疗都具有巨大的潜能，胚胎干细胞具有其他细胞不可比拟的特性使胚胎干细胞应用广泛，要合理控制胚胎干细胞在体内和体外的分化，关键要了解那些控制胚胎干细胞命运的基因［9-10］。FOXO3a在胚胎发育和维持胚胎干细胞多能性都具有重要作用。FOXO3a是FOX家族中的一个转录调控因子，它对胚胎上胚层及其衍生物的形成和建立多潜能胚胎干细胞系具有重要作用，并与控制胚胎发育和胚胎干细胞多能性的其他转录调控因子有一定的相关性。FOXO3a是维持胚胎上胚层细胞多潜能性和在体外建立胚胎干细胞系所必需的［11］。

本研究结果发现，FOXO3a随年龄的增加表达量明显增多FOXO3a作为卵泡活化分子之一，起了很重要的调节作用。实时荧光定量结果显示，组间比较，中年组FOXO3a高于青年组。组内比较，治疗后器质性病变的患者与功能性病变的患者卵巢中FOXO3a mRNA均明显升高，差异具有显著性(P＜0.05)，其中器质性病变FOXO3a mRNA水平低于功能性病变的患者，与治疗后比较差异更显著(P＜0.01)。提示FOXO3a为POF的可能的治疗靶点，FOXO3a基因联合干细胞修复化疗可促进POF的痊愈，同时年龄相对小的患者疗效会好于年龄偏大的患者，器质性病变的患者应用FOXO3a基因治疗辅助激素调节将将大大促进POF的治愈。本研究为POF的基因治疗提供了新的靶点和重要参考。

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