NGAL重组蛋白的表达与纯化及其促进结肠癌转移的研究＊

刘 桦，杨晓龙，唐 丽，胡开锋，刘明佳，刘 戟△

1.四川大学华西基础医学与法医学院 生物化学与分子生物学教研室（成都 610041）；2.成都医学院 生物医学系（成都 610500）

结肠癌是我国高发癌症之一，是发生于结肠部位常见的消化道恶性肿瘤，目前主要通过手术和化学药物治疗，但其预后欠佳［1］。约50%结肠癌患者发现时已是中晚期，因此，寻找结肠癌早期筛查和评估预后的良好肿瘤标志物一直是临床研究的热点。研究［2］表明，慢性炎症是结肠癌的一个重要特征，炎症因子通过调控肿瘤微环境，进而促进肿瘤生长和转移，因此寻找炎症标志物有利于结肠癌的诊断。

中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase－associated lipocalin，NGAL）参与抗微生物、抗氧化应激来保护正常组织。在一些炎症性疾病中，炎症因子促进NGAL表达上调。近年来研究［3］发现，NGAL在肿瘤中的表达不均一，依组织类型不同而表现各异。NGAL能够通过激活诱导表皮细胞向间质细胞转变（epithelialmesenchymal transition，EMT）来促进癌细胞转移，其有望成为一种潜在的结肠癌诊断标志物［4］。本研究通过对NGAL与结肠癌细胞转移关系的研究，以评价NGAL对结肠癌发生发展的潜在生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PCDNA3.1－NGAL质粒购买于上海艾博思生物有限公司；pet32a－tev、E.coilDH5α菌株、BL21－DE3菌株来自实验室保存；BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、T4连接酶、DNA Maker、蛋白质 Maker购于Fermentas公司；DNA胶回收试剂盒购于Tiangen公司；异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、基质胶购于Sigma公司；内毒素（LPS）购于Sigma公司；NGAL酶联免疫试剂盒购于武汉新启迪生物科技有限公司；人结肠癌细胞株SW480购于中国科学院细胞库，于－80℃冻存；NGAL抗体购于 Cell Signal Technology公司，其余抗体购于Santa Cruz公司；细胞培养基和胎牛血清购于 Gibco公司；PVDF膜和ECL显影液购于Millipore公司；X光胶片购于Kodak公司；其余化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SW480在含10% 胎牛血清DMEM培养基中（100U／mL青霉素，100μg／mL链霉素），于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 重组质粒构建 根据NGAL基因序列设计引物。上游引物5＇CGGGATCCATGCCCCTAG GTCTCCTGT 3＇，下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点；下游引物5＇CCCTCGAGTCAGCCGTCGATAC ACTGG 3＇，下划线部分为XhoⅠ酶切位点。以pcdna 3.1－NGAL质粒为模板进行PCR，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照回收试剂盒说明书纯化回收目的片段。将NGAL基因纯化产物与载体pet32a－tev分别用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶进行双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收线性载体与目的基因片段［5］。将NGAL目的基因与pet32a－tev线性载体以2∶1用T4连接酶22℃连接1h后，连接产物转化到大肠埃希菌感受态细胞E.coliDH5α中。挑取单克隆菌提质粒，送公司（华大基因）测序。

1.2.3 NGAL的表达与纯化将 pet32a－tev－NGAL载体转化到BL21－DE3，涂在含100μg／mL氨苄青霉素的LB平板中，挑取单克隆于LB培养基中。加入IPTG（终浓度0.2mmol／L），18℃诱导过夜，离心半径4cm，8 000r／min，离心15min，收菌。超声波破碎后离心收集上清，经亲和层析后，获得pet32a－tev－NGAL融合蛋白［6］。将融合蛋白经tev酶4℃酶切过夜，离心收集上清，将上清过阳离子树脂，得到NGAL蛋白。

1.2.4 内毒素检测 参考试剂操作说明书，以注射用生理盐水配制不同浓度内毒素标准品：0.25、0.125、0.062 5、0.031 25EU／mL，各取100μL加入检测试剂中，取NGAL蛋白溶液100μL加入检测试剂中。每个浓度重复3管，以生理盐水为阴性对照，于37℃培养箱中保温60min，以形成凝胶且不滑落为阳性，反之为阴性。观察NGAL的内毒素含量。

1.2.5 细胞划痕实验 将生长良好的SW480细胞以6×104个／孔接种于6孔板中，培养24h后，待密度达到90%以上时，用200μL的枪头在6孔板中划痕，PBS洗2次，加入50、100、200ng／mL 3个不同浓度NGAL双无培养基，继续培养48h。在48h时，照相观察划痕愈合情况。

1.2.6 细胞迁移实验 采用24孔板悬挂式Transwell小室，将经不同浓度NGAL处理48h后的细胞，PBS洗2次，用无血清培养液重悬。将200μL细胞悬液（3×105个／mL）加入上室，将含20%胎牛血清DMEM培养基540μL加入24孔板下室，每组设3个复孔，培养48h，取出小室，经4%多聚甲醛固定后，结晶紫染色，用湿棉签擦去膜上面未穿过膜的细胞，自然风干后［7］，在显微镜下照相，低倍镜下随机选取5个视野计数。最终以穿膜细胞的数目代表体外迁移能力。

1.2.7 细胞侵袭实验 将ECM基质胶按1∶5用无血清DMEM稀释，取50μL均匀涂在Transwell小室底部膜上室面，37℃培养箱培养4h，使基质胶自然聚合成凝胶。加入经不同浓度NGAL处理48h后的细胞，PBS洗2次，用无血清培养液重悬。将200μL细胞悬液（4×105个／mL）加入上室，将含20%胎牛血清DMEM培养基540μL加入24孔板下室，每组设3个复孔，培养48h，取出小室，经4%多聚甲醛固定后，结晶紫染色，用湿棉签擦去膜上面未穿过膜的细胞，自然风干后，在显微镜下照相，低倍镜下随机选取5个视野计数。最终以穿膜细胞的数目代表体外侵袭能力。

1.2.8 免疫印迹检测 收集经不同浓度NGAL处理后的细胞，按1×106个／mL细胞浓度加入100μL细胞裂解液，震荡，冰上放置1h，4℃，离心半径4cm，13 000r／min，离心15min，取上清液加上样缓冲液，85℃加热变性10min，样品中蛋白经BCA试剂盒定量，以确保蛋白上样量一致。通过12%SDS－PAGE电泳分离后，转膜至PVDF膜上。分别加入一抗（一抗稀释比例均为1∶1 000），4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，辣根过氧化物酶标记二抗（1∶5 000），37℃孵育1h，TBST洗涤PVDF膜5次，每次10min，加入ECL显影剂后，通过X光胶片曝光［8］。

1.2.9 ELISA检测血清中NGAL的表达量 参考试剂盒说明书，将正常人血清30例及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期结肠癌患者每期各30例，共150例的血清进行检测，以空白孔调零，酶标仪检测450nm波长下的吸收值。

1.3 统计学方法

ELISA实验数据记录为450nm处的光吸收值，细胞划痕实验中细胞划痕处为划痕愈合程度，迁移、侵袭实验中数据为穿过基质膜的细胞个数。采用SPSS 13.0软件进行数据处理，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用成组设计t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NGAL与结肠癌分期成正相关

为研究NGAL与结肠癌恶化的关系，收集了不同肿瘤分期患者的血样，通过ELISA实验对NGAL表达量进行检测，结果表明，随着肿瘤的恶化，NGAL表达量逐渐增加，二者成正相关。其中，Ⅳ期血样标本中，NGAL含量高达（160±10）ng／mL，与Tis血液样本比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 结肠癌各期NGAL表达量（n＝30，±s）

表1 结肠癌各期NGAL表达量（n＝30，±s）

注：与Tis比较，＊P＜0.05

Tis ⅠⅡⅢ Ⅳ结肠癌患者血液中 90±20 110±17 125±21 143±14 160±10＊NGAL含量／（ng／mL）

2.2 重组质粒构建、蛋白质纯化及内毒素检测

以pcDNA－NGAL载体为模板，进行PCR，1%琼脂糖凝胶电泳可见570bp左右的DNA片段，与预期一致。用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切载体pet32a－tev－NGAL后，1%琼脂糖凝胶电泳可见570bp左右和6 000bp左右的DNA片段。构建的重组质粒测序结果与NCBI数据库登陆序列一致（图1）。

图1 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物

用蛋白纯化仪过亲和层析柱，高浓度咪唑梯度洗脱，在咪唑浓度为100mmol／L ～200mmol／L时出峰，12%SDS－PAGE电泳验证，可获得纯度较高的融合蛋白，经tev酶酶切后，离子交换树脂纯化，在相对分子质量25×103处有明显的单一目的条带与NGAL分子量大小相符。纯化后的NGAL蛋白，经15%SDS－PAGE分析后，进行蛋白印迹鉴定，在相对分子质量约为25×103处可见特异性杂交带，表明为NGAL蛋白（图2）。

图2 纯化后NGAL蛋白的检测

内毒素检测：通过鲎试剂对纯化获得的NGAL蛋白进行内毒素检测，结果为内毒素含量＜0.125 EU／mg。

2.3 NGAL促进结肠癌细胞迁移和浸润

为研究NGAL对结肠癌转移的调控作用，使用不同质量浓度NGAL处理结肠癌细胞SW480 48h。通过细胞划痕实验、Transwell、基质胶实验对其迁移和侵袭能力进行检测。划痕实验结果显示，NGAL处理组的细胞明显向划痕处生长并靠拢，呈浓度依赖性。Transwell、基质胶实验分别检测NGAL对细胞迁移与浸润能力的影响，通过结晶紫染色并计数，NGAL处理组SW480比对照组细胞数明显增多，由此可见，NGAL促进结肠癌细胞SW480转移（图3～5）。

图3 划痕实验检测NGAL促进SW480转移（×10）

图4 Transwell检测NGAL对结肠癌SW480细胞迁移能力的影响（×10）

图5 基质胶实验检测NGAL对结肠癌SW480细胞浸润能力的影响（×10）

2.4 NGAL激活EMT信号通路

50、100 、200ng／mL NGAL处理 48h后，SW480细胞中的E－cadherin明显减少，并增强了N－cadherin和Vimentin的表达。同时，也增强了信号分子β－catenin的表达。结果表明，NGAL促进SW480的迁移和浸润能力。在癌症转移过程中，恶性基因MMP－9、MMP－2的表达有助于细胞间基质的降解［9］。同时，VEGF基因与结肠癌肿瘤血管生成、转移和肿瘤生长密切相关。本研究中，经过NGAL处理后，细胞胞内MMP－9、MMP－2 和VEGF的表达明显增强（图6）。

图6 Western blot检测EMT相关标志物

3 讨论

肿瘤转移是恶性肿瘤的主要特征之一，是导致患者死亡的首要因素，是癌细胞与宿主细胞相互作用的连续复杂过程［10］。EMT是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。N－cadherin、E－cadherin和βcatenin的改变导致了EMT的发生［11］。通过EMT过程，上皮细胞失去细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型［12］。因而，阐明调控恶性肿瘤细胞发生EMT过程的分子机制，并探索基于EMT关键分子的诊断方法及靶向EMT关键分子的治疗手段是肿瘤转移中EMT机制研究的关键性问题。

随着对NGAL在肿瘤领域的进一步研究发现，炎症反应和恶性肿瘤可诱使NGAL在多种肿瘤中表达上调，并在肿瘤复发与转移中发挥重要作用，NGAL参与了许多肿瘤的发生发展，在不同的肿瘤中，NGAL的功能表现与作用机制不尽相同，且在肿瘤中的表达是不均一的，依组织类型不同而表现各异，其分子机制还有待阐明［13］。本研究利用基因工程的方法，构建重组表达载体pet32a－tev－NGAL，转化入大肠杆菌（BL21－DE3）进行表达，经镍柱亲和层析纯化，tev酶酶切，再过HIS柱纯化，收集穿透峰获得NGAL蛋白。Western blot结果表明，NGAL能够激活肿瘤转移的重要信号途径——EMT途径；ELISA结果表明，NGAL的表达量与不同分期肿瘤恶化程度成正相关。通过对NGAL激活EMT信号通路促进结肠癌细胞SW480转移的研究，有助于为结肠癌以及其他肿瘤发生发展的分子机制研究提供帮助，同时也有助于进一步推进相关肿瘤临床诊断与治疗的应用基础研究。

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