趋化因子受体CCR6及其配体CCL20与结肠癌肝转移关系的实验研究

张 朋王金庆周 勇纪志鹏孟祥瑞葛运飞丁印鲁

趋化因子受体CCR6及其配体CCL20与结肠癌肝转移关系的实验研究

张 朋①王金庆①周 勇①纪志鹏①孟祥瑞①葛运飞①丁印鲁①

目的：探讨人趋化因子受体6（CCR6）及其配体CCL20的表达与结肠癌肝转移的关系。方法：选择2012年10月-2014年10月在本院行结肠癌根治术的患者93例作为研究对象，采用实时荧光定量PCR检测93例患者的结肠癌组织、正常肠黏膜组织及其中14例结肠癌肝转移组织、肝转移灶旁肝组织中CCL20及CCR6 mRNA表达情况，分析比较其差异。结果：CCR6及CCL20 mRNA在结肠癌和肝转移灶中高表达，并且均显著高于癌旁组织，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结肠癌组织中CCR6及CCL20 mRNA表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小及组织学类型无明显关系（P＞0.05），与TNM分期有关（P＜0.05）。结论：CCR6及其配体CCL20可能参与调节结肠癌向肝脏特异性转移过程。

趋化因子； 人趋化因子受体6； CC亚族趋化因子配体20； 结肠癌； 肝转移

结肠癌总发病率在欧美等发达国家占恶性肿瘤的第3位[1]。我国虽较发达国家发病率低，但近年有明显上升趋势[2]。其远处转移主要通过血管与淋巴管的机械运输作用，近年来研究结果显示趋化因子参与了肿瘤的远处转移[3-5]。本研究检测93例结肠癌组织及相应的肝转移组织中CCR6、CCL20 mRNA的表达，探讨信号转导通路成员CCR6及其配体CCL20在结肠癌肝转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年10月-2014年10月本院普外科收治的结肠癌根治术后患者93例作为研究对象，均经病理证实结肠癌。其中男49例，女44例；年龄29～86岁，中位年龄67岁；TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期39例，Ⅲ期28例，Ⅳ期19例，其中14例发生结肠癌肝转移。术后病理组织学类型包括：高中分化腺癌69例，低分化腺癌24例。

1.2 入选标准 （1）手术根治切除后病理诊断结肠癌；（2）美国癌症联合委员会（AJCC）的TNM分期为Ⅰ～Ⅳ期；（3）手术方式包括开腹及腹腔镜结肠癌根治术，包括右半结肠、横结肠、左半结肠切除术，行常规淋巴结清扫；（4）手术前未接受放化疗和生物治疗并且签署知情同意书。

1.3 实验方法

1.3.1 仪器与试剂 RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kits（德国Qiagen公司）；TaqMan2×PCR Master Mix、GeneAmp7900 Sequence Detection Systems（美国Applied Biosystems公司），DNA系列分析仪（美国Applied Biosystems公司）；流式细胞仪、QPREP标本处理仪（美国Coulter公司）；藻红素（PE）标记鼠抗人CCR6单抗（美国eBioscience公司）。

1.3.2 组织标本的准备 所有标本均于手术切除肿瘤后10～25 min内采集，结肠癌组织以及邻近正常肠黏膜组织（距肿瘤边缘大于5 cm），肝转移患者取肝转移灶及灶旁肝组织，所得标本立即置于液氮中保存。

1.3.3 总RNA的提取及单链cDNA的合成 取结肠癌组织75 mg，以液氮研磨，加1 mL Trizol混匀，15～30℃静置5 min。加入0.2 mL氯仿，充分振荡15 s，15～30℃静置3 min。12 000 r/min离心15 min，取上清，加入0.5 mL异丙醇，轻轻混匀，15～30℃静置10 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清。沉淀中加入75%的乙醇，混匀，7500 r/min离心5 min后弃上清，室温放置晾干。加适量的DEPC溶解。用紫外分光光度计测定其纯度及浓度后，取3 μg总RNA进行反转录。反转录用20 μL体系，包括2 μL 10×RT mix，2μL dNTP，2μL Oligo（dt），1 μL反转录酶，最后用DEPC液补至20 μL[6]。

1.3.4 引物、探针的设计与合成 将反转录后的cDNA模板用无菌去离子液稀释至300 μL，取5 μL为PCR模板。CCR6引物：上游5’-GGT CAA CTT TAA CTG TGG GAT G-3’，下游5’-GGT GTA GGC GAG GAC TTT CT-3’。CCL20引物：5’-AGC AGC AAG CAA CTA CGA CT-3’，下游5’-TCT TAG GCT GAG GAG GTT CA-3’。GAPDH引物上游：5’-ATG GGA AGC TGG TCA TCA AC-3’，下游：5’-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3’。PCR反应体系：2.5×SYBR 11.25 μL，上下游引物（10 μL/L）各1.25μL，模板5 μL，其余用无菌去离子液补足至25 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃15 s，60 ℃ 30 s，40个循环，收集溶解曲线。计算CCL20和CCR6基因相对于GAPDH的相对表达量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件处理数据。计量资料以（±s）表示，正态分布的资料比较采用t检验，非正态分布资料用Mann-Whitney U-test进行检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织CCR6、CCL20 mRNA表达情况比较 CCR6、CCL20 mRNA在结肠癌组织及肝脏转移组织中的表达量高于正常黏膜组织及肝转移灶旁组织，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同组织CCR6、CCL20 mRNA表达情况比较（±s）

表1 不同组织CCR6、CCL20 mRNA表达情况比较（±s）

CCL20 mRNA相对表达量正常黏膜组织（n=93）0.625±0.1820.754±0.074大肠癌组织（n=93）3.134±0.1962.006±0.044肝转移组织（n=14）3.537±0.1682.182±0.128肝转移灶旁组织（n=14）0.594±0.2420.783±0.122组织类型CCR6 mRNA相对表达量

2.2 CCR6、CCL20 mRNA表达与结肠癌临床病例特征的关系 CCR6、CCL20 mRNA表达与结肠癌患者性别、年龄、肿瘤大小及组织学分级无相关性（P＞0.05），与结肠癌的TNM分期相关（P＜0.05），见表2。

表2 CCR6、CCL20 mRNA表达与结肠癌临床病例特征的关系

3 讨论

趋化因子是一单链小分子蛋白质超家族，通过与受体的相互作用，引起靶细胞的定向迁移[7]。大多数趋化因子有4个特征性的保守的半胱氨酸（Cys），根据靠近分子氨基端（N端）的前2个Cys之间是否插入其他氨基酸，将它们分为4类：CXC类（如IL-8）、CC（如MCP-1）；CX3C类（如Fractalkine）及C类（如Lymphotactin）[8]。趋化因子受体是一类介导趋化因子行使功能的G蛋白偶连的跨膜受体（GPCR）。按趋化因子的分类，分为CC类受体（CCR）、CXC类受体（CXCR）、CX3C和C类受体（CX3CR、CR）[9]。趋化因子受体CCR6是趋化因子CCL20（又称巨噬细胞炎性反应蛋白-3α，MIP-3α）的专属受体（specific receptors），二者构成一个与细胞间信息传递、细胞迁移有密切关系的生物学轴，其实质在于CCR6对其配体CCL20的高度亲和力和绝对特异性。目前关于CCR6在肿瘤转移中的作用的研究尚处于起始阶段。Andre等[10]研究显示CCR6高表达与乳腺癌的胸膜转移转移相关；Rubie等[11]发现肝癌组织中CCR6与CCL20表达高于正常肝脏组织。胰腺癌组织存在趋化因子CCL20及其受体CCR6 mRNA的表达，CCL20可以显著促进人胰腺癌细胞株COLO-357的增殖和迁移[12]。CCL20还能够促进胰腺癌细胞株PANC-1侵袭，CCR6抗体可以阻断CCL20对胰腺癌细胞的促侵袭作用。正常肝组织和肝细胞癌组织中均有CCL20及CCR6表达，但癌组织中CCL20及CCR6表达显著升高[13]。CCR6尤其高表达于癌组织侵袭的前沿部分，这有助于表达CCR6的癌细胞在CCL20信号刺激下向周边浸润生长。

与正常结直肠组织相比，趋化因子受体CXCR4、CCR6、CCR7在结直肠癌原发瘤中均表达升高，但在肝转移瘤中仅CXCR4、CCR6升高；与食道、胃、结直肠等组织比较，肝脏组织中CCL12、CCL19、CCL21表达均无明显改变，而CCL20在肝组织中表达却明显升高，提示在肝脏分泌的CCL20诱导下，高表达CCR6的结直肠癌细胞可以发生定向迁移进而形成肝转移[14]。

CCR6、CCL20在结直肠癌组织中高表达，CCR6在多数肝转移标本中表达高于邻近正常肝组织。Ghadjar等[15]对64例结直肠癌标本进行免疫组化研究发现，CCR6高表达可以促进结直肠癌肝转移，CCR6表达程度是预测结直肠癌肝转移的独立因子。

本研究结果表明，CCR6、CCL20 mRNA在结肠癌及肝转移灶组织中的表达较相应的癌旁组织显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。CCL20、CCR6 mRNA的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小（T分期）、病理类型无明显相关性（P＞0.05），与TNM分期密切相关（P＜0.05），提示CCL20、CCR6轴与结肠癌肝转移关系密切，在结肠癌发生、发展、转移过程中发挥重要作用。这些结果不仅为结肠癌患者预后的判断提供了参考，而且为结肠癌肝转移的预防和临床治疗提供理论基础。

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Experimental Study of the Relationship between Human Chemokine Receptor 6，CC Chemokine Ligand 20 and Liver Metastasis of Colorectal Cancer

ZHANG Peng，WANG J in-qing，ZHOU Yong，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（23）：049-052

Objective：To investigate the relationship between CCR6，CCL20 and liver metastasis of colorectal cancer. Method：93 patients who received radical operation for carcinoma of colon in our hospital from October 2012 to October 2014were selected as the research objects.The expression situation of CCR6，CCL20 mRNA in 93 patients’ colorectal cancer tissues，normal mucosa tissues and 14 patients’ colorectal liver metastases tissues，adjacent nontumorous liver tissues was examined by real-time fluorescent quantitative PCR.The differences among them were analyzed and compared.Result：The expression of CCR6，CCL20 mRNA in colorectal cancer tissues and metastatic liver focus were significantly higher than in the adjacent tissues，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The expression of CCR6，CCL20 mRNA in colorectal cancer tissues had no significant correlation with the patients’ sex，age，tumor size and pathological types（P＞0.05），but it had a relationship with TNM-staging（P＜0.05）.Conclusion：CCR6 and CCL20 may take part in the regulation of colorectal liver metastasis.

Chemokine； Human chemokine receptor 6； CC chemokine ligand 20； Colorectal cancer； Liver metastasis

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.23.017

2015-05-03） （本文编辑：王利）

①山东大学第二医院 山东 济南 250033

丁印鲁

First-author’s address：The Second Hospital of Shandong University，J i’nan 250033，China