扶正活血中药对放射性肺损伤大鼠肺组织ET—1表达影响的实验研究

郑海红 甘梅富 魏科娜 翁寿向 徐铖 葛震

中医科，浙江临海 317000

[摘要] 目的 观察放射性肺损伤大鼠肺组织内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）的变化情况，探讨扶正活血中药在放射性肺损伤防治用途中的作用及其可能机制。 方法 56只SD雌性大鼠随机分为模型组（14只）、前期干预组（14只）、后期短程干预组（14只）和后期长程干预组（14只）4组，通过单次大剂量胸部照射制成放射性肺损伤大鼠模型，并用扶正活血中药进行干预，于照射后3个月、6个月两个时间点随机处死各组大鼠7只，取各组大鼠肺组织进行免疫组化检测ET-1蛋白表达水平。 结果 各干预组肺组织ET-1蛋白表达水平明显低于模型组。 结论 血浆ET-1水平的变化情况在某种程度上能反映放射性肺损伤的严重程度，扶正活血中药能抑制肺组织ET-1的表达，可能是扶正活血中药治疗放射性肺损伤的一个作用机制。

[关键词] 放射性肺损伤；扶正活血中药；内皮素-1

[中图分类号] R289.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）29-0026-03

Experimental study of the effect of Fuzheng Huoxue recipe on the expression of ET-1 in rats with radiation-induced lung injury

ZHENG Haihong1 GAN Meifu1 WEI Ke'na1 WENG Shouxiang1 XU Cheng1 GE Zhen2

1.Department of Pathology， Taizhou Enze Medical Center， Taizhou Hospital of Zhejiang Province， Linhai 317000， China； 2.Department of traditional chinese medicine， Taizhou Hospital of Zhejiang Province， Linhai 317000， China

[Abstract] Objective To observe the effect of Fuzheng Huoxue recipe on the expression of ET-1 in rats with radiation-induced lung injury，and discuss the prevention and curative effect of Fuzheng Huoxue recipe and its possible action mechanism. Methods 56 S-D rats were randomly allocated into irradiation group（n=14）， irradiation with early intervention group （n=14）， irradiation with short post-intervention group （n=14）， irradiation with long-term post-intervention group （n=14）， All groups were irradiated all chest with a single large dose . 7 rats in all groups were put to death at the end of the 3th， 6th month after the irradiation， then immunohistochemistry was used to assayed the levels of ET-1 in lung. Results The protein expression of ET-1 in Fuzheng Huoxue recipe-treated groups were significantly lower than that of the model group. Conclusion ET-1 could reflect the degree of radiation lung injury. Fuzheng Huoxue recipe could degrade the levels of ET-1 in lung tissues significantly. It might be one of their mechanisms in treatment of radiation-induced lung injury.

[Key words] Radiation-induced lung injury；Fuzheng Huoxue recipe；ET-1

放射治療是治疗胸部恶性肿瘤的主要手段之一，例如在肺癌、乳腺癌及食管癌等胸部肿瘤的放射治疗中，部分肺组织可能或多或少受到一定剂量的射线照射因而引起不同程度的放射性损伤，依疾病进展可以分为早期的放射性肺炎和后期的肺纤维化[1-6]。目前尚未完全阐明放射性肺损伤产生的机制，目前多数研究表明放射性肺损伤与多种因子过度表达相关[7-11]。内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）被看作为生物活性肽中的一种[12-14]，在特发性肺间质纤维化的发病过程中起一定作用，关于ET-1在放射性肺损伤中作用的相关文献尚不多见[15]。本实验通过建立放射性肺损伤动物模型，采用免疫组织化学方法检测ET-1在肺组织的表达，初步研究扶正活血中药在放射性肺损伤防治用途中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源

实验动物：56只健康成年清洁级SD雌性大鼠， 体重（200±10）g，购买于由温州医科大学实验动物中心，于清洁动物房常规饲养3 d后，观察无异常者方能入组实验。ET-1多克隆兔抗体浓缩液购自博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 分組 56只成年清洁级SD雌性大鼠，随机分为4组：模型组（单纯放射损伤）、前期干预组（放射前2周连续给药）、后期短程干预组（前期不做中药干预，放射后连续给药1个月）、后期长程干预组（前期不做中药干预，放射后连续给药3个月），每组14只。

1.2.2 模型制备 所有动物采用1%戊巴比妥钠（0.3 mL/100 g）腹腔内注射麻醉后，取仰卧位固定在特制木架上，充分暴露胸部范围，采用6MV-X线加速器设备，单次全胸照射剂量25 Gy，照射面积约3.5 cm×4.0 cm（上至两腋窝、下至胸骨及剑突，其余部分应用10 cm厚铅砖屏蔽），照射距离为100.0 cm，剂量率为320 cGy/min。

1.2.3 中药制备及给药方式 扶正活血法基础方由红景天、川芎、生黄芪、党参、生地黄、丹皮、白术、炙甘草、茯苓、丹参、当归、赤芍、灵芝和南沙参等常用中药组成，所用药物由台州医院中药房检验合格后提供，在中药房制剂室常温低压水煎浓缩成3.14 g/mL生药浓度的药液备用（中药换算方法以成人按60 kg体重一日剂量与大鼠平均250 g体重10倍系数换算）。每日每只动物3 mL灌胃一次。模型组：单纯放射损伤，前期及后期均不用中药干预；前期干预组：放射前2周连续给予扶正活血汤中药灌胃，放射后不做干预治疗；后期短程干预组：前期不做中药干预，放射后给予扶正活血汤连续灌胃1个月；后期长程干预组：前期不做中药干预，放射后给予扶正活血汤连续灌胃3个月。

1.2.4 取材 分别在放射后3个月、6个月两个时间点随机抽取并处死7只大鼠，迅速剖开其胸腔，剪断左右主支气管，取大鼠右肺中叶，固定于10%的甲醛溶液中，石蜡包埋组织以4 μm厚连续切片，行免疫组化检测ET-1的表达水平。

1.2.5 免疫组织化学方法 所有手术切除标本均经4%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋。免疫组化采用EnVision法，具体操作步骤严格按试剂说明书进行（以1∶100稀释），抗原修复采用高压锅高温修复，DAB显色，苏木精复染，乙醇脱水、透明、中性树胶封固，镜下观察。以PBS代替一抗作为阴性对照。光镜下观察胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性，颜色越深表达越强。

1.3 观察指标

观察各组大鼠肺组织中ET-1 蛋白表达情况。

1.4 统计学方法

应用SPSS18.0统计学软件分析，计数资料进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

正常肺组织ET-1 在支气管黏膜上皮，血管平滑肌以及其周围间质，肺泡上皮细胞及肺泡巨噬细胞有灶状阳性表达。模型组照射后ET-1在支气管上皮、肺巨噬细胞、上皮细胞、炎症细胞处阳性表达细胞数增多，有的阳性表达细胞连成一片，表达程度逐渐增强，血管平滑肌及其周围ET-1染色阳性从血管内皮细胞一直至血管周围。中药干预各组均见ET-1呈弱阳性表达（表1、封三图2～5），模型组、前期干预组、后期短程干预组、后期长程干预组ET-1的阳性率分别为100.0%（14/14）、64.3%（9/14）、64.3%（9/14）、50.00%（7/14），中药干预各组与模型组之间两两比较差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 各组ET-1阳性率

注：b vs a，χ2=6.0870，P=0.0136；c vs a，χ2=6.0870，P=0.0136；d vs a，χ2=9.3333，P=0.0023

3 讨论

本实验采用全肺单次照射造模，引起实验性大鼠的肺放射性损伤，并用扶正活血中药进行干预治疗，结果表明扶正活血中药能明显减轻肺水肿发生程度和炎症细胞渗出程度，效果较好。中医学认为，射线是热毒之邪毒，可损伤人体之正气及阴血。从症状上看，急性放射性肺炎属于咳、喘范畴，其发病机制为肺热血瘀、气阴两伤、宣肃失司[16]。

中药现代药理研究黄芪、川芎、党参和当归等具有提高机体免疫力、抑制血小板凝集、促进骨髓造血功能、抗氧化和清除自由基、提高肺表面活性物质、非特异性抗炎等作用[17-21]。本研究以扶正疗法为主，大补元气，使机体的正气增强，增强抵抗放射性损伤的能力，从而减轻放射性损伤的程度、减少放射性损伤的发生率。

肺是机体ET-1最重要的合成、代谢及作用的靶器官之一。研究结果证明ET-1具有加重及促进肺纤维化的双重作用[22]。ET-1能明显提高成纤维细胞的促有丝分裂作用，促使成纤维细胞DNA合成，加速细胞的增殖进程，而且可促进成纤维细胞合成I型胶原[23-24]。一些研究结果发现ET-1水平与肺纤维化严重程度和临床表现有一定程度的相关性。

本实验结果显示在照射后3个月，模型组肺组织中的ET-1呈强阳性表达，而中药干预各组均见ET-1呈弱阳性表达，表明随着放射性肺损伤的加重，肺组织ET-1表达会增强，提示ET-1水平能反映放射性肺损伤的严重程度。而ET-1主要特异性存在于支气管黏膜上皮细胞、肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞、浆细胞及Clara细胞，而正常大鼠肺组织中ET-1样免疫物质极为少见。在本实验条件下，随着照射后病程的发展，ET-1在肺组织表达亦增强，且放射性肺损伤越严重，肺组织表达亦越增强，扶正活血中药能明显抑制ET-1的表达程度。

综上所述，扶正活血中药治疗放射性损伤重要环节之一是扶正活血中药能抑制肺组织ET-1的表达，其作用机制尚未完全阐明，有待进一步研究。

[参考文献]

[1] 梁启廉，张英，赖振南，等. 同步放化疗对非小细胞肺癌患者Fas水平的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志，2008， 28（6）：628-631.

[2] Grassberger C，Sharp G，Fintelmann F，et al. SU-E-J-247：Time evolution of radiation-induced lung injury after stereotactic proton therapy[J]. Med Phys，2015，42（6）：3323.

[3] 趙廉栋，温馨，陈宇，等. 中医药防治放射性肺纤维化的进展[J]. 中国中医药现代远程教育，2013，11（7）：162-163.

[4] Lee SJ，Yi CO，Heo RW，et al. Clarithromycin attenuates radiation-induced lung injury in mice[J]. PLoS One，2015， 10（6）：e0131671.

[5] 王绿化，傅小龙，陈明，等. 放射性肺损伤的诊断及治疗[J].中华放射肿瘤学杂志，2015，24（1）：4-9.

[6] Fang XM，Hu CH，Hu XY，et al. An Appreciation for the rabbit ladderlike modeling of radiation-induced lung injury with high-energy X-ray[J]. Chin Med J （Engl），2015， 128（12）：1636-1642.

[7] 梁启廉，李志东，吴斌华，等. 抗Endoglin 单克隆抗体对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的影响[J]. 第四军医大学学报，2009，30（6）：520-522.

[8] Wang J，Zhang YY，Cheng J，et al. Preventive and therapeutic effects of quercetin on experimental radiation induced lung injury in mice[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2015，16（7）：2909-2914.

[9] 瞿述根，陈凡. 放射性肺损伤与细胞因子的研究进展[J]. 青海医学院学报，2014，35（3）：211-216.

[10] Xu F，Han JC，Zhang YJ，et al. Associations of LIG4 and HSPB1 genetic polymorphisms with risk of radiation-induced lung injury in lung cancer patients treated with radiotherapy[J]. Biomed Res Int，2015，2015：860373.

[11] 杨志勇，陈传喜. 非小细胞肺癌患者放射性肺损伤的临床特点分析[J]. 中国肿瘤临床与康复，2015，22（1）：7-8.

[12] Schophuizen CM，Hoenderop JG，Masereeuw R，et al. Uremic toxins induce ET-1 release by human proximal tubule cells，which regulates organic cation uptake time-dependently[J]. Cells，2015，4（3）：234-252.

[13] 梁启廉，银正民，张英，等. 化疗对胃癌患者血浆内皮素水平的影响及其临床意义[J]. 中国癌症杂志，2002 ，12（1）：62-64.

[14] Mansur A，Steinau M，Popov AF，et al. Genetic polymorphisms in endothelin-1 as predictors for long-term survival and the cardiac index in patients undergoing on-pump cardiac surgery[J]. PLo S One，2015，10（6）：e0131155.

[15] 刘欣，王炳胜，刘秀芳，等. 益气活血方对放射性肺损伤大鼠内皮素-1，γ-干扰素表达的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（24）：205-208.

[16] 李凤玉，王炳胜，刘秀芳，等. 益气活血中药对放射性肺损伤大鼠血清及肺组织ET-1表达影响的实验研究[J].临床军医杂志，2009，37（3）：350-352.

[17] 李庆. 黄芪的药理药效研究进展[J]. 医药产业资讯，2006，3（11）：128-129.

[18] 梁启廉，陈小东，李小英，等. 复方丹参滴丸加化疗治疗肝癌的临床疗效评价[J]. 中医药学刊，2006，24（1）：186-188.

[19] 梁启廉，潘达超，谢杰荣，等. 参芪扶正注射液配合化疗治疗中晚期大肠癌的临床研究[J]. 中国中西医结合杂志，2009，29（5）：439-441.

[20] 夏泉，张平，李绍平，等. 当归的药理作用研究进展[J]. 时珍国医国药，2004，15（3）：164-166.

[21] 梁启廉，潘达超，张英，等. 康艾注射液配合化疗治疗中晚期非小细胞肺癌临床研究[J]. 新中医，2009，41（7）：25-27.

[22] Anscher MS，Marks LB，Shafman TD，et al. Using plasma transforming growth factor beta-1 during radiotherapy to select patients for dose escalation[J]. J Clin Oncol， 2001， 19（17）：3758-3765.

[23] 孙燕妮，宋娟，陈洁，等. ET-1、TGF-β1对大鼠肺成纤维细胞CTGF表达及细胞增殖的影响[J]. 山东医药，2014，54（42）：29-31.

[24] Stanisz H，Stark A，Kilch T，et al. ORAI1 Ca（2+） channels control endothelin-1-induced mitogenesis and melanogenesis in primary human melanocytes[J]. J Invest Dermatol， 2012，132（5）：1443-1451.

（收稿日期：2015-04-03）