带状疱疹后遗神经痛大鼠脊髓背角组织MITOL表达变化及意义

涂涛，董蜀华

（成都医学院第一附属医院，成都 610500）

带状疱疹后遗神经痛（PHN）是中、老年人群的多发病之一，是公认的世界级疼痛顽疾。至今尚不清楚导致PHN的真正原因，但在神经病理性疼痛中，神经元线粒体功能障碍已成为共识的早期病理现象，而线粒体的形态和功能又与线粒体泛素连接酶（MITOL）息息相关［1］。PHN本身就是一种神经病理性疼痛，但目前国内外对MITOL与PHN的相关性报道较少。本研究通过建立大鼠PHN模型，以脊髓背角为靶点，运用行为学结合分子生物学的方法，研究脊髓背角组织中MITOL的表达变化及其与痛行为的相关性，以探寻PHN的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SD大鼠50只，2月龄，体质量180～200 g，由成都医学院动物实验中心提供。所有大鼠随机分为观察组和对照组各25只。

1.2 模型制备 将SD大鼠置于安静、18～22℃环境中，正常喂养48 h以上。观察组按照2004年Dalzial等［2］方法建立水痘带状疱疹病毒（VZV）慢性感染的动物模型。首先将CV-1细胞（非洲绿猴肾母纤维细胞）加入DMEM/F12完全培养基中制成细胞悬液，按5×104/cm2接种于培养瓶，再用VZV感染CV-1细胞，2 d后当大约有80%的细胞被感染时，用磷酸盐缓冲溶液收集被感染细胞，制成的细胞悬液即为病毒接种溶液，最后将50 μL（经测定大约包含6×106个被感染细胞）接种溶液注入SD大鼠左趾璞。对照组大鼠左趾璞注射同等剂量的0.9%氯化钠液。所有动物在饲养期间自由摄食和饮水，且均遵守《实验动物使用规范》。各组大鼠注射前及注射后 3、7、14、21 d检测大鼠左后足 PWTL、MWT［3］，每个时间点检测 5 只大鼠，并且在上午8:00～11:00进行。VZV感染后3天大鼠开始出现热痛敏阈值和机械痛敏阈值异常可判定制模成功。

1.3 大鼠脊髓背角组织MITOL检测 采用Western blotting法。在注射前及注射后 3、7、14、21 d 每组取5只大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠（60 mg/kg）深度麻醉，冰上处死后取出腰膨大节段脊髓背角组织，提取蛋白。Bradford法定量后，制备SDSPAGE胶，上样电泳，电转移至硝酸纤维素膜后牛奶封闭。然后分别加入MITOL抗体和β-actin抗体4℃过夜，漂洗3次后加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育2 h。按照发光试剂盒说明书进行放射自显影，并使用Flurochem 9900-50凝胶图像处理系统分析条带光密度，以MITOL与内参β-actin强度的比值作为结果。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用配对t检验，组内比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组大鼠脊髓背角组织MITOL表达比较见表1。

表1 两组大鼠脊髓背角组织MITOL表达比较（±s）

表1 两组大鼠脊髓背角组织MITOL表达比较（±s）

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与同组注射前比较，△P ＜0.01。

组别21 d观察组 13.18±1.14 37.52±3.51＊△ 56.08±4.03＊△ 68.43 ±4.17＊△ 52.61±3.37 MITOL注射前 注射3 d 注射7 d 注射14 d 注射＊△对照组 13.62 ±0.81 12.98 ±0.89 13.11 ±1.02 13.24 ±0.9612.83 ±0.95

3 讨论

PHN是带状疱疹最常见的并发症，其发生率随年龄的增长而增加，多有痛觉过敏和痛觉异常，严重影响患者的生活质量［4］。目前，对于PHN的治疗虽然有多种方法，但治疗效果均不佳。因此，亟待对PHN发病机制进行深入探索，以便能为有效预防或治疗此病药物或方法的研究提供理论依据。

众所周知，脊髓背角是传递外周伤害性信息的主要终止部位，也是下行抑制系统的终止部位之一。因此，脊髓背角是对痛信息进行加工、处理、整合的初级中枢，是研究痛与镇痛机制的突破口之一，可以说是痛觉传导的一个关键部位。所以，对于阐明线粒体功能障碍在脊髓水平参与痛和镇痛的机制而言，脊髓背角是理想的研究靶区［5］。带状疱疹并发PHN者存在脊髓背角损害，可见脊髓及以上水平可能也参与了PHN的发生发展。说明PHN的发生与周围及中枢神经的损害均有关，并且认为VZV通过直接感染脊髓或跨突触变形导致的中枢神经系统损伤，可能在PHN的发生中也起了关键作用［6］。

在细胞中，线粒体不是一成不变的，其形态、结构、数量和位置都处于一种动态的变化之中。其中分裂和融合是线粒体形态变化的两个主要方面，通过这种均衡来维持线粒体的形态和功能［7］，是维持线粒体氧化磷酸化的必需条件［8］。介导融合的关键蛋白是线粒体融合蛋白2，它是线粒体外膜上的跨膜GTP酶;而动力相关蛋白1重点参与线粒体的分裂。线粒体结构完整性与线粒体功能密切相关，线粒体结构破坏可直接影响线粒体膜电位、ATP合成等功能。值得注意的是，线粒体分裂和融合的动态平衡主要受到 MITOL 的调节［9，10］。MITOL 又名膜相关RING CH5，自2005年被发现以来，一直倍受关注。MITOL由278个氨基酸组成，位于线粒体外膜上，在C-端含有4个跨膜区域，N-端含有一个指环。而指环即是泛素传递活性的根本所在，早期研究认为如果缺乏MITOL或指环突变将会导致线粒体的碎裂，但近年来更多的资料显示缺乏MITOL的线粒体的形状会变长，引起细胞加速衰老，随即引起线粒体呼吸链氧化磷酸化功能障碍［11］。本研究显示，观察组注射 3、7、14、21 d MITOL 表达较对照组及同组注射前升高，充分说明线粒体的形态和功能一直处于MITOL的动态调控中。

综上所述，PHN大鼠脊髓背角组织MITOL蛋白表达增加，而且与痛觉阈值的高低紧密相关，可能参与了PHN的产生和维护。

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