HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA表达变化及其与血浆IFN-α水平的相关性

饶和平，金祥宁，卢伟力，彭晓蓉，靳昌忠

（1衢州职业技术学院医学院，浙江 衢州 324000;2金华职业技术学院医学院;3衢州市人民医院;4浙江大学医学院附属第一医院）

不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1（SAMHD1）是一种最新发现的HIV-1宿主限制因子，它高表达于髓系细胞，如树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞等，而在HIV-1容易感染的CD+4T 细胞中的表达却较低［1，2］。SAMHD1 是一种dGTP依赖的磷酸水解酶，能够将dNTPs水解成脱氧核苷和无机的三磷酸，从而降低细胞中dNTP水平，起到清除细胞内过剩的dNTPs的作用［3］。HIV-1感染细胞后，病毒RNA在逆转录酶的作用下形成病毒DNA，这时需要大量的dNTP，SAMHD1通过耗竭细胞内的dNTP使病毒的逆转录过程受阻，从而限制病毒的感染［4］。同时，SAMHD1也是目前已知惟一的HIV-1无法对抗的宿主限制因子。因此，SAMHD1的表达对HIV-1的感染及潜伏的形成十分重要。体外实验表明，SAMHD1的表达受干扰素 （IFN-α）调控，干扰素可以显著促进SAMHD1的表达［5］。HIV-1感染可以产生一系列的炎症反应和细胞因子的分泌，包括 IFN-α 水平的升高［6］。HIV-1 感染者 SAMHD1 mRNA的变化及其与IFN-α水平的关系目前尚未见报道。本研究观察了HIV-1感染者外周血单个核细胞（PBMC）中SAMHD1 mRNA，并分析了其与血浆IFN-α水平的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年5～10月于浙江大学附属第一医院就诊的HIV-1感染者78例，其中32例未接受抗病毒治疗，男22例，女10例;年龄（37.8±7.6）岁;46例接受高效抗逆转录病毒治疗（HAART）1 a以上，男33例、女13例，年龄（35.93±11.57）岁，治疗时间（3.1 ±1.2）a;所有 HIV-1 感染者均经初筛和确认试验HIV-1抗体阳性，近期无机会性感染或肿瘤以及HBV/HCV合并感染。另外招募正常对照者 28例，男21例、女7例，年龄（38.29±12.51）岁。各组一般资料无统计学差异，具有可比性。本研究得到浙江大学附属第一医院伦理委员会批准，所有研究方案均告知患者本人，并签订知情同意书。

1.2 PBMC中SAMHD1 mRNA检测 每位受试对象抽取EDTA抗凝血5 mL，用于PBMC分离、流式细胞术和病毒载量检测。采用密度梯度离心法（Ficoll淋巴细胞分离液）分离上述抗凝血，得到PBMC。用TRIzol溶液溶解上述细胞，按照说明书，提取总体RNA。取1 μL RNA，利用 PrimeSciptTM逆转试剂盒逆转录为cDNA。采用20 μL反应体系，取1 μL cDNA反应产物，加入SYBR定量检测混合试剂中，利用Light Cycler2.0定量PCR仪扩增、检测。反应条件:先在95℃反应30 s，再在95℃、5 s和60℃、20 s条件下反应40循环。利用2-ΔΔCt相对定量法计算SAMHD1 mRNA。

1.3 血浆 IFN-α 水平检测 采用人 IFN-α ELISA检测试剂盒检测血浆IFN-α水平，操作按照说明书所述步骤进行。

1.4 血浆HIV病毒载量检测 采用HIV-1 Monitor 1.5（Roche）商品化试剂盒，在COBAS Amplisemsor-PCR仪上对血浆样品的HIV-RNA作定量分析，操作严格按照试剂盒说明进行，结果以每毫升血浆含病毒拷贝数表示，最低检测限50拷贝/mL。

1.5 外周血CD+4、CD+8T细胞数检测 采用流式细胞仪和CD3/CD4/CD8三色标记单抗绝对定量试剂盒进行检测，取全血50 μL，用20 μL单克隆抗体混合物孵育1 h，用红细胞裂解液裂解红细胞之后上机检测。用System U软件进行分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，采用单因素方差分析对多组数据进行统计学分析，其中两两比较采用LSD法。相关性分析采用Pearson相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PBMC中 SAMHD1 mRNA及血浆 IFN-α水平比较 结果见表1。

表1 各组PBMC中SAMHD1 mRNA及血浆IFN-α水平比较（ ± s）

表1 各组PBMC中SAMHD1 mRNA及血浆IFN-α水平比较（ ± s）

注:与正常对照组比较，*P ＜0.01。

组别 n SAMHD1 mRNA IFN-α治疗组 46 1 278±276* 67.5±15.7*未治疗组 32 1 422±319* 51.6±10.3*正常对照组28 684±183 27.2± 9.1

2.2 各组血浆HIV病毒载量及外周血CD+4T细胞、CD+8T细胞数比较 结果见表2。

表2 各组血浆HIV病毒载量及外周血CD4+T细胞、CD8+T 细胞数比较（±s）

表2 各组血浆HIV病毒载量及外周血CD4+T细胞、CD8+T 细胞数比较（±s）

注:与未治疗组比较，*P ＜0.05;与正常对照组比较，△P ＜0.05。

组别 n 病毒载量（log10）CD+4T细胞数CD+8T细胞数（个/μL）（个/μL）治疗组 46 0.81 ±1.25* 452.05 ±161.20＊△835.88 ±370.36未治疗组 32 4.44 ±0.93 325.17±188.83△ 1 056.81±523.02正常对照组28 - 693.52 ±148.26 983.46 ±508.94

2.3 相关性分析 HIV-1感染者PBMC中SAMHD1 mRNA与病毒载量、CD+4T细胞数量无相关性（r分别为 -0.306、0.064，P均 ＞ 0.05），与血浆IFN-α 水平呈正相关（r=0.324，P＜0.05）。

3 讨论

固有免疫和获得性免疫在抗HIV-1及其机会性感染中发挥了重要作用，特别是固有免疫，是近年来抗HIV-1感染免疫研究的热点。SAMHD1在固有免疫系统中扮演重要角色。SAMHD1功能的缺失可以造成细胞内dNTPs的大量积聚，从而引发强烈的免疫活化和大量的 Ⅰ 型干扰素分泌［7，8］。因此，SAMHD1这种通过清除过剩的dNTPs来减少核酸代谢引起的免疫活化的能力，使它与固有免疫反应紧密地联系起来，又被形象地称为“IFN反应的负性调节器”［7，9］。SAMHD1 对固有免疫应答的调控在HIV-1感染中的作用尚不清楚。一方面，SAMHD1对Ⅰ型干扰素分泌的抑制作用可能促进HIV-1的感染;另一方面，SAMHD1通过避免免疫系统过度活化以减少CD+4T细胞的活化和HIV-1的感染。此外，SAMHD1还是HIV-1感染的重要宿主限制因子。HIV-1难以有效感染DC、单核细胞、巨噬细胞等髓系细胞的主要原因是这些髓系细胞高表达SAMHD1［4，10］。敲除 SAMHD1 基因后，这些髓系细胞就丧失了对HIV-1感染的抵抗性，可以被HIV-1大量感染［11］。SAMHD1对HIV-1感染的限制是通过降低HIV-1逆转录所需的原料dNTPs的浓度来实现的［12］。SAMHD1基因缺陷的AGS患者的单核细胞更容易感染HIV-1，进一步在人体原代细胞上验证了 SAMHD1 的 HIV-1 感染限制功能［13，14］。

SAMHD1在固有免疫调控及HIV-1感染中的重要作用。本研究显示，HIV-1感染者PBMC中SAMHD1表达及 IFN-α水平升高，SAMHD1表达与IFN-α水平呈正相关，而与CD+4T细胞数量和病毒载量无关。SAMHD1在抑制Ⅰ型干扰素过度分泌的同时，其自身的表达又受干扰素的调控。SAMHD1最初是作为一种IFN-γ诱导的蛋白被发现的［15］。此外，有报道［16］IFN-α 也可以诱导 SAMHD1的表达。我们在前期研究中发现，IFN-γ可以在 THP-1和Jurkat细胞上诱导SAMHD1的表达［17］。这样，SAMHD1与干扰素形成了一个互相调控的复杂网络。Buitendijk等在研究Toll样受体（TLRs）的免疫应答时发现，TLR9活化时伴有SAMHD1表达的升高。结合TLRs在病毒感染免疫应答中的重要作用，HIV-1感染是否可以通过TLRs通路调控SAMHD1?本研究结果提示，HIV-1感染上调SAMHD1表达的机制可能是通过IFN-α的调节实现的。HIV-1感染靶细胞后，可以通过与Toll样受体结合，促进IFN-α以及多种促炎因子的表达，而IFN-α水平的升高又可以上调SAMHD1的表达，来抑制免疫系统的过度激活，同时抑制HIV-1感染新的靶细胞。

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