丁苯酞氯化钠注射液后处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马CA1区凋亡相关因子表达的影响

邱振方，邓春颖，李世英，张晋霞，贺永贵，余 红，刘 斌

0 引 言

丁苯酞氯化钠注射液治疗缺血性脑血管病是近年医学领域研究的热点。药物后处理指在缺血和再灌注之间对局灶性脑缺血进行处理，可更好地模拟人类疾病的发展规律。国内外研究证实丁苯酞氯化钠注射液后处理可通过多种机制产生神经保护作用［1-2］，如抗细胞凋亡、保护线粒体、促进微循环等，但其抗细胞凋亡作用的具体机制尚未阐明。X连锁凋亡抑制蛋白(X-inhibitor of apoptosis，XIAP)、Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirusE1B19kDa interacting protein 3，BNIP3)是近年来发现的2种凋亡相关蛋白，丁苯酞对其作用的研究不多［3-4］。因此本研究旨在研究丁苯酞氯化钠注射液后后处理对大鼠大脑中动脉IR模型大鼠的神经行为学、梗死体积及海马CA1区细胞凋亡情况及凋亡相关因子XIAP、BNIP3的蛋白表达、基因表达的影响，并探讨丁苯酞对局灶性脑IR大鼠的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 65只清洁级雄性SD大鼠，体重200～250g，鼠龄8周。由华北理工大学实验动物中心提供，动物许可证编号:SCXK(军)2009-003，适应性饲养1周，室温(23±2)℃，相对湿度55%。术前12 h禁食、禁水。将大鼠随机分为假手术组(n=13)、IR 组(n=13)、丁苯酞组(n=39);丁苯酞组按照剂量不同分为低剂量亚组(2 mg/kg)，中剂量亚组(4 mg/kg)和高剂量亚组(6 mg/kg)，每组13只。其中每组5只大鼠用于氯化三苯四氮唑磷酸盐染色，5只大鼠用于TUNEL染色和免疫组化检查，3只大鼠用于RT-PCR检查。

1.2 动物模型制作 每只大鼠采用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射方法麻醉。IR组:参照Zealonga线栓法加以改良制备大鼠大脑中动脉IR模型［4］，不分离颈内动脉，暴露右侧颈总动脉后，结扎颈外动脉远端、夹闭颈内动脉近心端与颈总动脉远心端，直接将圆头栓线插入颈总动脉，向上经颈内动脉遇到轻微阻力时停止进线，缺血2h时立即拔回栓线，形成再灌注，24 h后处死大鼠。低、中、高剂量亚组:在大鼠缺血2h后，拔出栓线的同时给予腹腔内分别注射2、4、6mg/kg丁苯酞氯化钠注射液(石药集团恩必普药业有限公司)，余步骤同IR组。假手术组:栓线插入深度＜10mm，余步骤同IR组。各组大鼠均于再灌注24h时间点处死，迅速断头取脑，分别制作石蜡切片标本与新鲜脑组织标本。

1.3 各组大鼠神经行为学比较 参照ZeaLonga评分法，在大鼠清醒后进行神经行为学评估。评分在0～3分者纳入实验［5］。

1.4 脑梗死体积的测定 每组随机选取5只大鼠脑组织，冰冻后按2 mm厚度冠状切片，将切片放入2%氯化三苯四氮唑磷酸盐缓冲液中，37℃避光孵育30 min。正常脑组织染成红色，梗死灶为白色。采用Motic Image Advance 3.0多媒体彩色病理图像分析系统进行处理，计算梗死灶体积占缺血侧大脑半球总体积的百分比。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡 常规方法制作石蜡切片，切片脱蜡至水化;3%H2O2封闭RT 10 min之后用PBS液清洗;复合消化液37℃孵育20min之后用PBS液清洗;TUNEL混合液(1∶9)37℃孵育1 h;POD转化剂(抗FITC-HRP)37℃ 40min之后PBS液清洗;DAB显色;苏木精复染;脱水、透明封固。图像分析:每张切片在高倍显微镜(×400)下观察海马CA1区大致相同部位的5个互不重叠视野，计数阳性细胞数量。

1.6 免疫组化染色检测蛋白表达 常规方法制作石蜡切片，预热20 min后脱腊至水化，用3%H2O2封闭非特异性抗原10 min，采用高压修复10 min，滴加适当比例稀释的一抗(浓度:XIAP 1∶50，BNIP3 1∶200)4℃，第2天用二抗37℃孵育，滴加DAB溶液显色，苏木精复染细胞核，切片经乙醇脱水干燥，中性树胶封固(阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同)。图像分析:每张切片在高倍显微镜(×400)下分别观察海马CA1区大致相同部位的5个互不重叠视野，计数阳性细胞数量。

1.7 RT-PCR法检测mRNA表达 取大鼠海马CA1区脑组织，按Trizol法，提取总RNA;XIAP:上游引物 GGCGGTTAGTTAGGACTGG;下游引物GGACTGCTGCTTGGGAAGT;BNIP3:上游引物GGCGGTTAGTTAGGACTGG，下游引物GGACTGCTGCTTGGGAAGT;β-actin:上游引物 ACGGTCAGGTCATCACTATCG，下游引物 GGCATAGAGGTCTTTTACGGATG;扩增条件:采用RT-PCR一步法扩增程序:扩增条件为:42℃ 5min 95℃ 5s，95℃ 10s 60℃30 s，设置为 40 cycles，结果分析:比较 CT 值，以2-^^ct法计算XIAP、BNIP3的相对表达量。

1.8 统计学分析 采用 SPSS17.0软件进行统计学分析。定量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较视方差齐性检验，当方差齐时，选择 LSD检验;当方差不齐时，选择 Tamhane's T3检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分 假手术组大鼠均活动自如，神经功能缺损评分均为0分;丁苯酞低剂量亚组评分［(2.59±0.18)分］、中剂量亚组评分［(2.42±0.27)分］和高剂量亚组评分［(2.21±0.69)分］均小于 IR 组［(2.73 ±0.20)分］，且各亚组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 大鼠脑梗死体积测定 假手术组脑组织未见梗死灶，呈现均匀一致的红色;IR组梗死灶体积百分比［(37.03±0.85)%］最为明显，呈现中心区为白色，周围为红白交界区。丁苯酞低剂量亚组脑梗死体积为(33.21± 0.61)%，中 剂 量 亚 组 为 (30.64 ±0.74)%，高剂量亚组为(17.58 ±0.83)%，3 亚组间脑梗死体积差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠缺血侧海马CA1区TUNEL染色结果 TUNEL染色后，凋亡细胞胞核呈紫黑色着色，胞核固缩，颗粒深染，呈椭圆形、圆形及不规则形，为散在性及弥散性分布。假手术组可见少量凋亡细胞表达［(4.78±0.57)个/Hp］。海马 CA1区的凋亡细胞数:丁苯酞低剂量亚组［(67.48±0.43)个/Hp］、中剂量亚组［(63.43 ±0.74)个/Hp］、高剂量亚组 ［(58.01± 0.69)个/Hp］均 少 于 IR 组［(78.07 ±0.38)个/Hp］，且低、中、高剂量亚组凋亡细胞数逐渐减少，各亚组间比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。见图1。

图1 丁苯酞各剂量亚组海马CA1区凋亡细胞表达(TUNEL×400)Figure 1 Apoptotic cells in the hippocampus CA1 neurons of focal cerebral ischemia reperfusion rats treated with different doses of dl-3N-butylphthalide(TUNEL×400)

2.4 各组大鼠缺血侧海马 CA1区 XIAP、BNIP3阳性细胞表达结果 免疫组化染色镜下细胞浆呈棕黄色者为XIAP阳性细胞，镜下细胞浆和细胞核均呈棕黄色者为BNIP3阳性细胞。与假手术组XIAP、BNIP3阳性细胞表达比较，IR组明显增多(P＜0.05);与IR组XIAP阳性细胞数比较，丁苯酞各亚组明显增加(P＜0.05)，而BNIP3阳性细胞数明显减少(P＜0.05);且丁苯酞低、中、高剂量亚组XIAP阳性细胞数表达逐渐增多，BNIP3阳性细胞数表达逐渐减少，不同亚组之间比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)。见表1，图2、图3。

表1 各组大鼠 XIAP、BNIP3阳性细胞数比较(±s，个/HP)Table 1 Expression of XIAP-and BNIP3-positive cells in different groups of rats(±s，A/HP)

表1 各组大鼠 XIAP、BNIP3阳性细胞数比较(±s，个/HP)Table 1 Expression of XIAP-and BNIP3-positive cells in different groups of rats(±s，A/HP)

与假手术组相比，*P＜0.05;与IR组相比，#P＜0.05;与低剂量亚组比较，△P ＜0.05;与中剂量亚组比较，▲P ＜0.05

组别 n XIAP阳性细胞数 BNIP3阳性细胞数假手术组5 3.07 ±1.43 5.78 ±0.44 IR 组 5 22.31 ±0.94* 60.13 ±2.59*丁苯酞组低剂量亚组 5 28.70 ±1.18# 52.07 ±1.02#中剂量亚组 5 32.79±0.88#△ 40.30±2.00#△高剂量亚组 5 37.01±1.24#△▲ 31.04±0.43#△▲

图2 丁苯酞各剂量亚组海马CA1区XIAP阳性细胞表达(IHC×400)Figure 2 Expression of XIAP-positive cells in the hippocampus CA1 neurons of focal cerebral ischemia reperfusion rats treated with different doses of dl-3N-butylphthalide(IHC×400)

图3 丁苯酞各剂量亚组海马CA1区BNIP3阳性细胞表达(IHC×400)Figure 3 Expression of BNIP3-positive cells in the hippocampus CA1 neurons of focal cerebral ischemia reperfusion rats treated with different doses of dl-3N-butylphthalide(IHC×400)

2.5 大鼠缺血侧海马 CA1区大鼠 XIAP、BNIP3 mRNA表达比较 IR组XIAP、BNIP3 mRNA表达量较假手术组增多(P＜0.05);与IR组比较，丁苯酞各亚组XIAP mRNA表达量增加、BNIP3 mRNA表达量减少(P＜0.05);且低、中、高剂量亚组 XIAP mRNA表达随剂量浓度增加而逐渐增多，BNIP3 mRNA表达逐渐减少，各亚组间差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠缺血侧海马CA1区XIAP、BNIP3 mRNA相对浓度(±s，个/HP)Table 2 Expression of XIAP and BNIP3 mRNA in different groups of rats(±s，A/HP)

表2 各组大鼠缺血侧海马CA1区XIAP、BNIP3 mRNA相对浓度(±s，个/HP)Table 2 Expression of XIAP and BNIP3 mRNA in different groups of rats(±s，A/HP)

与假手术组比较，*P＜0.05;与IR组比较，#P＜0.05;与低剂量亚组比较，△P ＜0.05;与中剂量亚组比较，▲P ＜0.05

组别 n XIAP mRNA BNIP3 mRNA假手术组3 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 IR 组 3 1.76 ±0.04* 3.59 ±0.14*丁苯酞组低剂量亚组 3 2.45 ±0.05# 2.83 ±0.12#中剂量亚组 3 5.03±0.16#△ 2.03±0.17#△高剂量亚组 3 5.40±0.20#△▲ 1.67±0.29#△▲

3 讨 论

丁苯酞氯化钠注射液是我国自主研发的治疗急性缺血性脑血管病的国家一类新药［6］。临床及动物实验研究均表明，丁苯酞可通过影响缺血瀑布的改变，阻断缺血区域神经元凋亡，减轻神经功能损伤的程度、减小梗死面积及记忆障碍［7］。既往的研究大部分着重于观察丁苯酞氯化钠注射液预处理的干预效应［8］，但预处理对于临床的应用空间狭小，药物依从性差。因此本研究选用丁苯酞氯化钠注射液后处理的方式干预IR过程。

在脑梗死病理生理发展过程中，细胞凋亡占有重要地位。XIAP既能抑制凋亡发生又能抑制凋亡进展，主要通过 Caspase经典途径发挥作用［9］。BNIP3是目前发现唯一通过多种途径引起缺血性神经细胞死亡的因子［10］，张明海等［11］发现脑缺血可诱导海马神经元BNIP3上调。本研究结果显示:与假手术组比较，IR组海马CA1区XIAP、BNIP3阳性细胞的表达均增多(P＜0.05)，说明人体正常的免疫应答中神经细胞仅表达少量XIAP、BNIP3，这与Asa等研究一致［12-14］，而脑组织发生IR后，一系列的病理生理改变会导致XIAP、BNIP3蛋白表达上调。XIAP抑制细胞凋亡、参与脑缺血耐受的途径主要有:①XIAP通过抑制Caspase3和Caspase7等的活性阻止脑神经功能的进一步恶化、改善脑神经功能;②当存在外界刺激时，如炎症因子(TNF-α、IL-1β、LPS等)损伤内皮细胞，XIAP的表达能诱导NF-kB的活化，通过NF-kB途径促进XIAP基因表达，促进IAPs等的产生，从而抑制Caspase激活引起的细胞凋亡［15］;③XIAP的 RING锌指结构可使Caspase3、7和9发生降解，从而降低凋亡的敏感性;④体外实验证实，XIAP通过 TAK1和TAB1信号(属MAPKKK成员)介导激活JNK1，从而抑制细胞凋亡。随着丁苯酞剂量的增加，XIAP阳性细胞表达逐渐增多，BNIP3阳性细胞表达逐渐减少，各亚组之间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。提示丁苯酞氯化钠注射液能够通过上调抗凋亡蛋白XIAP的表达，下调促凋亡蛋白BNIP3的表达参与凋亡的发生发展。刘新建等［16］研究提示XIAP在再灌注的早期升高可能为机体应激时所产生的一种自我保护反应，是一种内源性保护作用，但短暂升高后又下降，同时很快受到表达上调的Smac/DIABLO的抑制。本研究RT-PCR结果显示:与假手术组比较，IR组海马CA1区XIAP、BNIP3 mRNA的表达呈现出增多趋势，且差异均有统计学意义(P＜0.05)，其增多的机制可能是发生急性IR时XIAP、BNIP3 mRNA表达增多，并在短时间内形成大量XIAP、BNIP3 mRNA，进而促进了相应蛋白的产生。缺血缺氧状态下低氧诱导因子(hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α)表达明显增多，HIF-1可诱导促凋亡蛋白BNIP3高度聚集。研究表明HIF-1α是诱导BNIP3表达的最强刺激因子［17］。以上趋势均表明在发生IR后，丁苯酞不仅影响XIAP、BNIP3蛋白水平，而且还通过促进抗凋亡基因XIAP、抑制促凋亡基因BNIP3的转录参与IR大鼠的凋亡进程。

IR是一个复杂的过程，关系到多种基因的调控、转录因子的表达和众多蛋白的产生［18-19］。目前研究认为XIAP、BNIP3的异常表达与IR的发生、进展和预后密切相关。本研究表明丁苯酞氯化钠注射液可明显调节其活性，这对于维持机体动态平衡与稳态维持具有积极意义。

［1］ LIAO SJ，LIN JW，PEI Z，et al.Enhanced angiogenesis with dl-3n-butylphthalide treatment after focal cerebral ischemia in rhrsp［J］.BrainRes，2009，12(89):69-78.

［2］ Wang HM，Zhang T，Huang JK，et al.3-N-butylphthalide(NBP)attenuates the amyloid-β-induced inflammatory responses in cultured astrocytes via the nuclear factor-κB signaling pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2013，32(1):235-242.

［3］ 罗 超，吕淑英，潘龙瑞，等.左旋丁苯酞对慢性脑缺血大鼠海马β-淀粉样肽及Tau蛋白磷酸化的影响［J］.中国医药导报，2015，12(13):58-60.

［4］ 赵素晨，吴庆文，程月发，等.丁苯酞对SH-SY5Y细胞凋亡的影响［J］.中国康复理论与实践.2015，21(4):412-416.

［5］ Zealonga E，Weistein PR，Calson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlousion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84-91.

［6］ 李同凯，郑会城，高 伟，等.丁苯酞联合纳洛酮治疗后循环缺血性眩晕症的疗效观察［J］.医学研究生学报，2014，27(8):839-841.

［7］ 刘首峰，尉辉杰，王晓静，等.丁苯酞对血管性痴呆大鼠认知功能及海马区核因子-κB表达的影响［J］.中国现代医学杂志，2012，22(29):49-52.

［8］ 潘 娟，陈淅泠，李秋霞.丁苯酞预处理对脑缺血大鼠的保护作用［J］.临床神经病学杂志，2013，26(1):44-46.

［9］ Zhang T，Jia W，Sun X.3-n-Butylphthalide(NBP)reduces apoptosis and enhances vascular enhances endothelial growth factor(VEGF)up-regulation in diabetic rats［J］.Neurol.Res.2010，390-396.

［10］ Larisa V F，Anita T，David J K，et al.Mitochondrial impairment in the five-sixth nephrectomy model of chronic renal failure:proteomic approach［J］.Biological Chemistry.2013，14(3):209-211.

［11］ 张明海，方莹莹，李树基，等.脑缺血后海马CAI区casPase非依赖性凋亡相关蛋白表达水平的改变［M］.中国神经科学学会第九届全国学术会议暨第五次会员代表大会论文摘要集，2011:330.

［12］ Asa B，Gustafsson.Bnip3 as a Dual Regulator of Mitochondrial Turnoverand Cell Death in the Myocardi-um［J］.Pediatr Cardiol，2011，32(3):267-274.

［13］ Fuida S.Inhibitor of apoptosis(IAP)Proteins:novel insights into the cancer-relevant targets for cell death induction［J］.ACS Chem Bio，2009，4(7):499-501.

［14］ 李 茜，陈兴东，段满林.急性脑缺血对机体免疫系统的影响［J］.医学研究生学报，2013，26(6):654-657.

［15］ 刘 颖，聂咏梅，吴伟康.延迟预适应减少大鼠心肌缺血再灌注的细胞凋亡［J］.基础医学与临床，2009，29(4):379-382.

［16］ 刘新建，温慧敏，黄 英，等.大鼠缺氧缺血后海马神经元凋亡及凋亡抑制蛋白XIAP表达的变化［J］.中国老年学杂志，2013，33(10):2323-2324.

［17］ 张捍军，邓艳丽，苏丹颖，等.UCF-101对大鼠脑缺血再灌注后凋亡抑制蛋白XIAP表达的影响［J］.解剖科学进展，2011，17(3):223-226.

［18］ 代海滨，胡益民，嵇 晴，等.硫化氢复合浅低温对突触内N-甲基-D-天冬氨酸受体及其反应元件结合蛋白信号通路的影响［J］.医学研究生学报，2014，27(7):686-689.

［19］ 李冬梅，徐丽，张淑珍，等.芍药苷对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.医学研究生学报，2014，27(11):1139-1142.