日本乙型脑炎LAMP方法的建立和应用

孙圣福 陈静 田夫林 马惠玲 楚遵锋 王敏（山东省动物疫病预防与控制中心 250022）

日本乙型脑炎LAMP方法的建立和应用

孙圣福 陈静 田夫林 马惠玲 楚遵锋 王敏（山东省动物疫病预防与控制中心 250022）

日本乙型脑炎（Japaneseencephalitis，JE，简称乙脑）是一种由乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）引起的人畜共患的病毒性疾病。对于人类和动物的健康有极大的威胁，主要引起人的神经性疾病以及猪的繁殖障碍。

本研究针对乙型脑炎病毒的M基因设计一套RT-LAMP特异性引物，建立了用于乙脑病毒快速诊断的病原学检测方法。与传统的RT-PCR方法相比，该方法操作简便，时间短，对仪器设备要求较低，检测结果肉眼下即可观察结果，临床应用简便。

1 材料和方法

1.1 材料

病毒：乙脑减毒克隆98株；临床病料来自本实验室门诊采集自山东省各市县养猪场疑似乙脑的病料。

1.2 主要仪器和试剂

凝胶成像及分析系统为美国BIO-RADGEL型，PCR仪为德国Biometra公司生产的Tgradient型，台式冷冻离心机为德国Sigma2k-15型，生物安全柜为NU-425-400E3型，电泳槽为北京六一仪器厂。

Loopamp试剂盒购自荣研株式会社，SYBRGREENI核酸染料购自Solarbio公司；DL2000DNAMarker、20bpLadder DNAMarker、反转录酶M-MLV、一步法RT-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；RNA提取试剂Trizol购自大连宝生物公司。日本乙脑RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司。

1.3 引物

根据已经报道的JEV的M基因，利用LAMP引物在线设计软件PrimerExplorerV4.0设计出RT-LAMP反应中使用的4条特异性引物，引物由TAKARA公司合成，序列如下：

表1 引物序列

1.4 核酸提取

待检样品100ul，加Trizol试剂1ml。充分混匀，室温5min，加三氯甲烷 200ul，混匀，室温 5min。12000rpm，15min（2～8℃），取上清80%于另一离心管，加入500ul异丙醇， 混匀， 室温 10min， 12000rpm， 10min（2～8℃）， 弃上清，加75%乙醇洗涤，7500rpm，5min（2～8℃），弃上清，风干，加20ul0.1%DEPC水溶解，-20℃储存备用。

1.5 RT-LAMP体系优化

根据反应体系优化策略，对反应温度、Mg2+浓度、甜菜碱浓度、引物浓度进行优化，反应温度依次：60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，甜菜碱浓度分别为0.5、1、1.5、2M，内引物浓度分别为1.2、1.6、2.0、2.4μM，外引物浓度分别为0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0μm，反应时间：20、30、45、60min，确定最佳的反应体系，25μl反应体系：F3/B3 0.2μm、 FIP/BIP1.6μm、 dNTP0.4mm、 MgSO44mm、 Betaine1M、 BstDNA 聚合酶 1μl、 10×Thermobuffer2.5μl、 AMV反转录酶10U，RNA酶抑制剂20U，模板2μl，ddH2O补齐至 25μl。 63℃45min， 80℃2min。 取 6μl扩增产物于 1%琼脂糖凝胶上进行电泳，剩余产物中加入1μl核酸染料观察颜色变化。

1.6 特异性试验

分别以猪瘟病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒等作为样品，同时设立阴性对照，提取核酸，采用已经优化的反应条件，检验所建立的RT-LAMP方法的特异性。

1.7 灵敏性试验

将病毒样品进行 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6进行十倍比稀释，提取核酸，同时设立阴性对照，提取核酸，采用已经优化的反应条件，检验所建立的RT-LAMP方法的灵敏性；同时进行RT-PCR试验，比较两种方法的灵敏性。

1.8 临床应用

采集临床繁殖障碍的猪组织样品27份，提取核酸，采用建立的RT-LAMP方法和RT-PCR方法同时进行检测。

2 结果与分析

2.1 反应条件优化

参见图1～图4。

图1 不同温度梯度

图2 不同甜菜碱浓度

图3 不同引物浓度梯度

图4 不同反应时间

2.2 RT-LAMP特异性试验

参见图5。

图5 RT-LAMP特异性试验

2.3 RT-LAMP灵敏性试验

参见图6～图7。

图6 RT-LAMP灵敏性试验

图7 RT-PCR灵敏性试验

2.4 临床应用

乙脑RT-LAMP临床应用情况，见表2。

表2 乙脑RT-LAMP临床应用情况

3 结论

（1）通过RT-LAMP反应条件筛选，确定了乙型脑炎RT-LAMP的最佳反应条件。

（2）通过灵敏性试验、特异性试验，确定RT-LAMP能特异性的检测乙脑病毒，检测灵敏度为10-5，而RT-PCR检测灵敏度为10-3，RT-LAMP的灵敏性较RT-PCR高100倍。

（3）RT-LAMP方法反应条件为63℃，只用一个水浴锅即可完成试验，检测结果眼观，更为直观，因此适于临床上应用。

作者：孙圣福（1978-），山东省聊城市人，主要从事动物疫病分子生物学诊断工作。

山东省农业重大应用技术创新课题——规模化猪场猪繁殖障碍病防治与快速检测技术的研究。