窄谱中波紫外线联合干扰素治疗蕈样肉芽肿疗效及其与Treg/Th17细胞相关性研究

侯秀丽 王平 黎钊 聂慧琼 刘东银

窄谱中波紫外线联合干扰素治疗蕈样肉芽肿疗效及其与Treg/Th17细胞相关性研究

侯秀丽 王平 黎钊 聂慧琼 刘东银

目的 观察窄谱中波紫外线（NB-UVB）单独或联合干扰素治疗覃样肉芽肿（MF）的疗效，探讨外周血调节性T（Treg）细胞和辅助性T细胞17（Th17）细胞与疗效的相关性。方法 33例ⅠA期-ⅡA期MF患者按照治疗方法分为两组，分别应用NB-UVB单独照射（照射组）和NB-UVB照射联合重组人干扰素（INF）-α-2b肌内注射（联合组）治疗。于治疗前和治疗9个月后分别采集患者外周血，流式细胞仪检测Treg细胞和Th17细胞百分率。以10例健康人外周血为对照组（健康对照组）。结果 平均治疗时间9个月，照射组15例中，完全缓解6例，部分缓解3例，无效6例，联合组18例中，完全缓解12例，部分缓解5例，无效1例，联合治疗效果显著优于单独治疗（P=0.023）。治疗前两组患者外周血Treg和Th17细胞百分率均明显高于健康人（均P＜0.05），两患者组间差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后两患者组Treg和Th17细胞百分率均显著下降，但仍高于健康对照组（均P＜0.05）。联合组Treg和Th17细胞降幅均大于照射组（均P＜0.05）。7例治疗无效患者治疗后外周血Treg细胞较治疗前亦有降低（P＜0.05），Th17细胞无显著下降（P＞0.05）。结论 NB-UVB照射联合INF-α-2b肌内注射治疗MF临床疗效优于单独使用NB-UVB，疗效可能与外周血Treg和Th17细胞降幅有关。

紫外线疗法；干扰素α；治疗结果；T淋巴细胞，调节性；Th17细胞；蕈样肉芽肿

蕈样肉芽肿（MF）是一种低度恶性皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL），大多起源于记忆性辅助性T细胞（CD4+T细胞），约占CTCL的50%［1］。典型 MF呈慢性惰性病程，经历红斑期、斑块期到肿瘤期可达几十年时间，因此，多数MF采用非化学药物治疗，其中，紫外线照射和干扰素注射治疗是早期MF最经典有效的治疗方法［2］。研究发现，外周血和皮损组织中调节性T（Treg）细胞和辅助性T细胞17（Th17）与MF病程密切相关［3］，且在MF等肿瘤性疾病的发生、发展及治疗评估方面发挥重要作用［4-5］。本研究对33例早期MF病例长期随访，比较窄谱中波紫外线（NB-UVB）和 NB-UVB 联合干扰素（INF）-α-2b治疗早期MF的疗效，比较治疗前后外周血Treg和Th17细胞与疗效的动态变化，分析外周血Treg和Th17细胞与疗效的相关性。

对象与方法

一、对象

1.临床资料：33例可随访患者均为我院皮肤科2008年7月至2013年7月经临床、组织病理、免疫表型和（或）基因重排克隆分析确诊的MF病例，且无其他合并症。男21例，女12例，发病年龄（31.7±16）岁，病程6月至17年，按TNMB分级均为MF早期（ⅠA期-ⅡA期）病例，对所有病例均进行登记、拍照、跟踪随访。按照抽签法随机分为两组：照射组15例采用单独NB-UVB照射治疗，男10例，女5例，平均年龄（30.8±12）岁，ⅠA～IB期10例，ⅡA期5例；联合组18例采用NB-UVB照射联合INF-α-2b注射治疗，男11例，女7例，平均年龄（31.9±14）岁，ⅠA～ⅠB期11例，ⅡA期7例。平均治疗时间约9个月，治疗后随访时间3个月至3年。组间患者年龄、性别及病情严重程度差异无统计学意义（均P＞0.05）。另外设健康对照组，男6例，女4例，年龄（32.2±2.1）岁，均来自同期健康体检人员，年龄与照射组、联合组差异也无统计学意义（均P＞0.05）。本研究获得杭州市第三人民医院医学伦理委员会批准，入选病例均签署知情同意书。

2.主要仪器和试剂：Waldmann Medizintechnik UV7001 UV.B（德国Waldmann公司），SS-05紫外线光疗仪（上海希格玛高技术有限公司），波长311 nm。人Treg/Th17试剂盒以及同型对照抗体均产自美国BD公司。佛波酯、离子霉素混合液产自杭州联科生物技术有限公司。淋巴分离液产自美国Sigma公司；RPMI1640培养液产自美国Gibco公司；胎牛血清产自浙江天杭生物科技有限公司。

二、治疗方法

1.NB-UVB治疗：照射组和联合组均接受此治疗。起始剂量为500 mJ/cm2，根据皮肤反应情况增减剂量，以10%～20%为宜。每周照射2～3次。如果单一增加剂量达不到疗效，可增加照射次数至隔天1次，直至皮肤微红后维持该剂量照射，最大剂量不超过2.0 J/cm2。30次为1个疗程，此后维持治疗，1周或2周照射1次。2010年前，7例（照射组3例，联合组4例）维持治疗，2010年后，26例（照射组12例，联合组14例）不再维持治疗，若有复发反复治疗。

2.干扰素治疗：联合组18例患者接受重组人INF-α-2b（商品名因特芬，沈阳三生制药有限责任公司）治疗，采用300万IU肌内注射，每周2～3次，3～6个月症状明显缓解后，逐渐减至每周1次肌内注射，维持3～6个月，平均治疗时间9个月。

3.疗效评价［6］：治疗 9 个月，完全缓解：皮损完全消退，并维持4周以上；部分缓解：皮损消退≥50%，并维持4周以上；无效：皮损消退＜50%或无变化。

三、外周血Treg/Th17细胞检测

于治疗前及治疗9个月后采集患者肘静脉血5 ml，入组时采集健康对照组肘静脉血5 ml，肝素抗凝，3 000 r/min（半径5 cm），离心15 min分离血浆。将下层血细胞与PBS缓冲液1∶1混合后缓慢加入4 ml淋巴细胞分离液中,获得外周血单一核细胞（PBMC）。用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液重悬PBMC，加入4 μl佛波酯、离子霉素混合液（250X）和4 μl蛋白转运抑制剂（包含莫能星），在37℃，5%CO2培养箱中培养5 h。离心，应用胎牛血清（美国BD公司配套染色缓冲液）洗涤1遍，调整细胞浓度为2×106/ml，按照Th17/Treg PhenotyPing试剂盒说明操作，应用流式细胞仪进行检测。

四、统计学处理

结 果

一、临床疗效

照射组15例中，完全缓解6例，部分缓解3例，无效6例。联合组18例中，完全缓解12例，部分缓解5例，无效1例。照射组和联合组患者平均30次照射治疗，皮损情况明显好转，斑块、斑片逐渐消退，瘙痒减轻，外观皮肤基本正常，恢复时间2.5～3个月。其中照射组2例部分缓解患者和联合组1例部分缓解患者病情有反复，重复治疗后疗效明显。Fisher确切概率法显示两组有效率差异有统计学意义（P=0.023），联合组疗效优于照射组。

二、患者组治疗前后和对照组外周血Treg和Th17细胞水平比较

照射组和联合组早期MF患者外周血Treg及Th17细胞百分率治疗前差异无统计学意义（均P＞0.05），但显著高于对照组（均P＜0.05）。治疗后，照射组患者外周血Treg和Th17细胞百分率较治疗前明显下降（t值分别 为 4.954、3.828，均P＜ 0.05），联合组亦显著下降（t值分别为11.813、12.582，均P＜0.05），且联合组Treg和Th17细胞降幅大于照射组（均P＜0.05）。见表 1，图1。

表1 健康人及蕈样肉芽肿患者治疗前后外周血Treg及Th17细胞百分率比较（%，±s）

表1 健康人及蕈样肉芽肿患者治疗前后外周血Treg及Th17细胞百分率比较（%，±s）

注：a：与治疗前比较，P ＜ 0.01；与照射组降幅比较，b：P ＜ 0.05，c：P ＜ 0.01

照射组 15 7.71±0.90 5.84±2.24a 1.88±1.47 3.41±1.20 2.68±1.52a 0.72±0.73联合组 18 7.03±1.27 4.26±2.01a 2.78±1.00b 3.17±0.95 1.69±1.10a 1.48±0.50c健康对照组 10 0.69±0.24 - - 0.41±0.27 - -F值 174.691 - - 35.203 - -P值 ＜0.01 - - ＜0.01 - -

图1 1例蕈样肉芽肿患者治疗前后Th17、Treg细胞比例 1A：治疗前；1B：治疗9个月后

三、不同疗效患者外周血Treg和Th17细胞水平比较

33例患者根据疗效分为3组，其中完全缓解组18例，部分缓解组8例和无效组7例，3组治疗后Treg细胞百分率较治疗前均显著下降（均P＜0.05）；完全缓解组与部分缓解组Th17细胞百分率治疗后较治疗前均显著下降（P＜0.05），而无效组Th17细胞下降不明显（P＞0.05）。方差分析显示，3组间Treg和Th17细胞降幅差异有统计学意义（均P＜0.01）；完全缓解患者外周血Treg细胞降幅大于部分缓解患者和无效患者（均P＜0.05）；完全缓解和部分缓解患者Th17细胞降幅显著大于无效患者（均P＜0.01），但完全缓解和部分缓解患者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 疗效不同的蕈样肉芽肿患者治疗前后外周血Treg及Th17细胞百分率比较（%，±s）

表2 疗效不同的蕈样肉芽肿患者治疗前后外周血Treg及Th17细胞百分率比较（%，±s）

注：a：与治疗前比较，P ＜ 0.05；b：与无效组比较，P ＜ 0.05

Treg细胞 Th17细胞治疗前 治疗后 降幅 治疗前 治疗后 降幅完全缓解组 18 6.52±0.70 3.17±0.72a 3.35±0.63b 2.54±0.75 1.19±0.50a1.35±0.57b部分缓解组 8 8.04±0.81 6.23±0.80a 1.82±0.38b 3.79±0.25 2.36±0.35a1.44±0.33b无效组 7 8.65±0.54 8.19±0.59a 0.46±0.28 4.60±0.53 4.34±0.94 0.26±0.74 F值 28.748 140.009 82.476 31.279 72.688 10.868 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01组别 例数

四、不良反应

联合组2例患者首次注射INF-α-2b出现轻微流感样反应，低热，继续治疗后不良反应消失。照射组无不良反应发生。

讨 论

NB-UVB与长波紫外线相比，疗效相当，但副作用明显减少，不易灼伤皮肤，患者依从性较强［7-8］。NB-UVB可以逆转以及提高机体免疫功能，促成表皮细胞的再生以及恢复，其治疗MF机制可能与抑制表皮朗格汉斯细胞的抗原提呈功能、直接诱导表皮中T淋巴细胞凋亡并抑制真皮T淋巴细胞浸润有关［9］。虽然高剂量和低剂量NB-UVB都能减少表皮中朗格汉斯细胞数量，但低剂量相对高剂量效果更好。因此，在减少表皮中朗格汉斯细胞数量上，小剂量慢速递增的照射方法优于快速递增的方法［10］。干扰素是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的具有多种功能的活性蛋白［11］，其抑制细胞分裂的活性有明显的选择性，对肿瘤细胞的活性抑制作用比正常细胞大上千倍。INF-α-2b抗肿瘤可直接抑制肿瘤细胞增殖，也可通过调节宿主免疫机制抑制肿瘤的生长，它对体液免疫、细胞免疫均有调节作用，对巨噬细胞及自然杀伤（NK）细胞也有一定的免疫增强作用［12］。干扰素是临床上治疗MF的一种经典有效的手段，通常低剂量不引起或者只引起轻微不良反应［13］。本研究选择的33例早期MF患者分组后分别用NB-UVB治疗和INF-α-2b联合NB-UVB治疗，结果显示联合治疗具有更好的疗效。

Treg细胞和Th17细胞均参与自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的发生和发展。研究表明，其在炎症性疾病和肿瘤性疾病发展过程中呈递增趋势［14-15］，成为近年来医学研究的一个热点。Treg细胞和Th17细胞在炎症反应中的作用可能相反。我们［3］对MF各期Treg细胞和Th17细胞的关系进行研究，发现早期MF患者外周血中Treg细胞与Th17细胞的数量呈正相关，表明二者存在相互作用。

本研究结果显示，早期MF患者外周血Treg及Th17细胞百分率高于健康对照，提示Treg及Th17细胞可能在MF发病中起作用，经联合治疗症状缓解后患者外周血Treg及Th17细胞百分率均明显降低,提示MF的病情活动度与外周血Treg及Th17细胞百分率有一定关联。另外，本文结果发现：联合治疗疗效显著优于单独治疗，且联合治疗外周血Treg和Th17细胞降幅显著高于单独治疗，可能与干扰素通过抑制Treg细胞功能提高机体的免疫功能状态有关。无效患者也有Treg细胞的下降，且部分缓解和完全缓解组之间，Th17降幅差异无统计学意义，提示MF生物学行为的复杂性，Treg细胞与Th17细胞并非是决定MF治疗反应的唯一因素。

本研究表明，重组人INF-α-2b联合NB-UVB组治疗效果明显优于单纯NB-UVB治疗组，虽有不良反应但可耐受，是一种安全有效的治疗方法。

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2014-07-14）

（本文编辑：尚淑贤）

Therapeutic effect of narrow band-utraviolet B combined with interferon-alpha-2b for the treatment of mycosis fungoides and its correlation with Treg/Th17 cells

Hou Xiuli*,Wang Ping,Li Zhao,Nie Huiqiong,Liu Dongyin.*Department of Dermatology,Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University,Hangzhou 310009,China

Wang Ping,Email：dermwang@aliyun.com

ObjectiveTo evaluate the therapeutic effect of narrow band-ultraviolet B （NB-UVB）alone or in combination with interferon-alpha-2b（INF-alpha-2b）for mycosis fungoides（MF）,and to assess the correlation between the therapeutic effect and peripheral blood regulatory T （Treg）/T helper type 17 （Th17）cells.MethodsThirty-three patients with stage IA to IIA MF were randomly divided into two groups：NB-UVB group （n=15）receiving NB-UVB radiation alone,combined group （n=18）treated with NB-UVB radiation and intramuscular injection of INF-alpha-2b.Ten healthy volunteers were selected as the control group.Peripheral blood samples were collected before and 9 months after the start of treatment.Flow cytometry was performed to determine the percentages of Treg cells and Th17 cells.Statistical analysis was carried out by usingttest,one-way analysis of variance,and Fisher′s exact test.ResultsThe average treatment duration was 9 months among these patients.Therapeutic outcomes were significantly better in the combined group than in the NB-UVB group （P=0.023）.Among the 15 patients in the NB-UVB group,6 achieved complete remission,3 partial remission,6 showed no response;of the 18 patients in the combined group,12 experienced complete remission,5 partial remission,and 1 showed no response.Before the treatment,the percentages of both Treg and Th17 cells in peripheral blood were significantly higher in the NB-UVB group and combined group than in the control group（bothP＜ 0.05）,but similar between the NB-UVB group and combined group（bothP＞ 0.05）.After the treatment,the percentages of both Treg and Th17 cells in the NB-UVB group and combined group significantly decreased compared with those before the treatment,but were still higher than those in the control group （bothP＜0.05）.Additionally,the degree of decrease in the percentages of Treg and Th17 cells was significantly greater in the combined group than in the NB-UVB group（bothP＜ 0.05）.The seven patients with no response also showed a significant decrease in the percentage of Treg cells（P＜ 0.05）,but no obvious changes in that of Th17 cells（P＞ 0.05）after the treatment.ConclusionsThe therapeutic effect of NB-UVB radiation combined with intramuscular INF-alpha-2b is superior to that of NB-UVB radiation alone for MF,which may be associated with the degree of decrease in peripheral blood Treg and Th17 cells.

Ultraviolet therapy;Interferon-alpha;Treatment outcomes;T-lymphocytes,regulatory;Th17 cells;Mycosis fungoides

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.003

浙江省医药卫生科技计划项目（2014KYB200）；杭州市医学重点专科专病项目（20100733Q08、20140733Q19）

310009杭州，安徽医科大学附属杭州临床学院皮肤科（侯秀丽、王平、聂慧琼）；杭州市第三人民医院皮肤科（黎钊、刘东银）

王平，Email：dermwang@aliyun.com