过表达NF-E2相关因子2对白癜风黑素细胞PIG3V线粒体生物合成和功能的影响

朱龙飞 田军 坚哲 刘邦民 肖茜 李春英 高天文

过表达NF-E2相关因子2对白癜风黑素细胞PIG3V线粒体生物合成和功能的影响

朱龙飞 田军 坚哲 刘邦民 肖茜 李春英 高天文

目的 探讨过表达NF-E2相关因子2（Nrf2）对黑素细胞线粒体合成和功能的影响。方法 构建含有人Nrf2基因全长的过表达质粒Nrf2-pEX-1，用该质粒瞬时转染白癜风患者表皮黑素细胞系（PIG3V）。实验分为空白组（不含质粒）、对照组（转染pEX-1空质粒）、过表达组（转染pEX-1-Nrf2过表达质粒）。过表达Nrf2后，RT-PCR和Western印迹法检测PIG3V线粒体生物合成相关的Nrf2、核呼吸因子1（NRF1）、线粒体转录因子A（TFAM）mRNA和蛋白水平的变化；RT-PCR检测线粒体DNA（mtDNA）拷贝数。流式细胞仪检测线粒体膜电位（MMP）；荧光素酶报告系统检测细胞ATP含量。采用两样本t检验进行统计学分析。结果 Nrf2过表达质粒转染PIG3V细胞后24 h，Nrf2 mRNA、NRF1 mRNA水平较对照组明显升高，差异有统计学意义（均P＜0.001），而TFAM mRNA水平与对照组比较差异无统计学意义；48 h后Nrf2 mRNA、TFAM mRNA水平较对照组升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），而NRF1 mRNA水平与对照组差异无统计学意义。Western印迹法显示，转染后24 h，过表达组Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表达与对照组比较差异均无统计学意义，48 h后过表达组Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表达升高（P＜0.05）。过表达组MMP在转染24 h后较对照组升高2.313%（t=5.546，P=0.005），48 h后升高14.872%（t=8.537，P=0.001）。线粒体合成指标相对mtDNA拷贝数，在转染24 h后两组间差异无统计学意义（P＞0.05），48 h后过表达组明显高于对照组（t=5.760，P=0.005）；细胞ATP含量在转染后24 h两组间差异无统计学意义（P＞0.05），48 h后过表达组ATP含量较对照组明显升高（t=22.040，P=0.008）。结论 过表达Nrf2可以促进黑素细胞线粒体生物合成相关基因和蛋白的表达，进而促进线粒体生物合成，上调线粒体功能相关的指标。

白癜风；黑素细胞；线粒体；NF-E2相关因子2；腺苷三磷酸

白癜风是一种获得性色素脱失性疾病，其发病机制不明，黑素细胞氧化应激损伤在白癜风的发生、发展中起关键作用［1］。线粒体是细胞内重要的能源工厂和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）来源，也是氧化应激损伤首当其冲的攻击靶点［2］。白癜风患者皮损周围黑素细胞、角质形成细胞和朗格汉斯细胞以及外周血单一核细胞中线粒体形态及功能均发生异常［3］。临床研究发现，线粒体刺激剂联合抗氧化剂可有效改善稳定期白癜风患者症状，使皮损区色素得到恢复［4］。核因子 E2相关因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）通路是细胞内重要的抗氧化通路，可促进下游多种抗氧化因子的表达，发挥抗氧化作用。在过表达Nrf2后线粒体生物合成增加，功能改善，小鼠肝脏细胞坏死、凋亡减少［5］。Nrf2在肝脏、心肌细胞中促进线粒体生物合成、改善线粒体功能的作用，在白癜风黑素细胞是否存在［5-6］。本研究采用过表达质粒转染技术上调白癜风患者表皮黑素细胞系（PIG3V）Nrf2的表达，探讨对线粒体生物合成和功能的影响。

资料与方法

一、资料与试剂

1.细胞来源：白癜风患者表皮黑素细胞系PIG3V，由美国伊利诺斯州芝加哥Loyola大学Caroline Le Poole博士赠送。该细胞系运用反转录病毒载体转染16型人乳头状瘤病毒E6和E7开放读码框得来，与正常黑素细胞生物学特性相似。

2.主要仪器和试剂：254培养基、HMGS、脂质体Lipofectamine 2000为美国Gibco公司产品。Nrf2基因全长过表达质粒由上海吉玛制药技术有限公司设计、合成，基因长度1 770 bp，克隆载体为pEX-1，克隆位点为XhoI/BamHI；Trizol试剂、反转录cDNA试剂盒、SYBR Premix Ex Taq II试剂盒为大连TaKaRa公司产品；Nrf2、核呼吸因子 1（NRF1）、线粒体转录因子A（TFAM）、ND4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。Nrf2、NRF1、TFAM兔抗人单克隆抗体为美国Abcom公司产品。抗β肌动蛋白鼠单克隆抗体、辣根过氧化物（HRP）标记羊抗兔（羊抗鼠）IgG产自北京康为世纪生物科技有限公司。MitoTracker®Red CMXRos为美国Invitrogen公司产品。Enliten®ATP检测试剂盒产自美国Promego公司。Bio-rad IQ5实时荧光定量PCR仪。BD FACSAria流式细胞分选仪。美国promega公司E5311荧光素酶报告系统。

二、方法

1.Nrf2基因全长过表达质粒瞬时转染PIG3V细胞体系的建立：转染需用无抗生素无血清的培养基，所用枪头、微量离心管均需用DEPC水做无核酶、无DNA处理。瞬时转染同时在6孔板和25 cm2培养瓶中进行，以便用于线粒体合成相关基因和蛋白表达、mtDNA拷贝数、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）、细胞 ATP含量等检测。实验分为空白组（不含质粒）、对照组（转染pEX-1空质粒）、过表达组（转染pEX-1-Nrf2过表达质粒）。6 孔板每孔质粒 4 μg，脂质体 12 μl；25 cm2培养瓶每瓶质粒 12 μg，脂质体 30 μl。按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行瞬时转染，转染后无血清254培养基37℃培养，6 h后换液，24 h观察荧光。本质粒带绿色荧光，成功转染的细胞在蓝光激发下胞质显示颗粒状绿色荧光。

2.实时荧光定量PCR检测与线粒体合成相关的 Nrf2、NRF1、TFAM mRNA 水平：提取处理后PIG3V细胞的mRNA，定量，反转录成cDNA。PCR引物序列：Nrf2 正向：5′-CTTGGCCTCAGTGATTCTG AAGTG-3′，反向：5′-CCTGAGATGGTGACAAGGGT TGTA-3′；NRF1 正向：5′-CCACGTTACAGGGAGGT GAG-3′，反向：5′-TGTAGCTCCCTGCTGCATCT-3′；TFAM 正向：5′-ACAGGATGATGACTATGGAA-3′，反向：5′-CAACTCTGAATACAATGTGAATT-3′；β 肌动蛋白正向 5′-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，反向：5′-GAAGGAAGGcTGGAAG AGTG-3′。PCR 扩增体系包括：cDNA模板2μl，引物正向和反向各1μl，SYBR Premix Ex Taq II 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl。扩增条件：预变性 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，共 40 个循环，95℃ 1 min，65 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，1 个循环。在实时荧光定量PCR仪上读取Ct值。以β肌动蛋白作为内参照。采用2-ΔΔCt法计算对特异性扩增的目的基因进行相对定量。

3.Wesrern印迹法检测线粒体合成相关蛋白的表达：提取处理后PIG3V细胞总蛋白。蛋白定量，煮沸变性，电泳并用半干转法转膜，封闭，分别加入兔抗人 Nrf2、NRF1、TFAM 抗体，4 ℃摇床上过夜，洗膜，加二抗，室温2 h，洗膜，曝光显影。以β肌动蛋白作为内参照对所得蛋白条带图进行灰度分析。

4.线粒体生物合成检测：通过检测细胞全基因组中mtDNA拷贝数来评价线粒体生物合成水平，选择线粒体DNA特征性基因ND4作为检测的目标基因，设计引物。PCR引物序列：ND4基因正向：5′-CCATTCTCCTCCTATCCCTCAAC-3′，反向：5′-CAC AATCTGATGTTTTGGTTAAACTATATTT-3′。提取处理后细胞总DNA，定量。PCR扩增体系包括：DNA模板 0.36 μg（体积不同），10 μmol/L ND4引物 F 端和 R 端各 1 μl，SYBR Ⅱ Premix Ex TaqTM12.5 μl，加ddH2O适量补足反应体系至25 μl。扩增条件、结果分析同上文。相对mtDNA拷贝数=ND4基因DNA拷贝数/β肌动蛋白基因拷贝数。

5.MMP检测：常规消化细胞，生理氯化钠液洗1遍，将MitoTracker®Red CMXRos按1∶5 000用无血清254培养基稀释，用稀释液重悬细胞，37℃孵育30 min，每10分钟振荡1次，其后生理氯化钠液洗3遍，用适量生理氯化钠液重悬，上流式细胞仪，检测PE通道的平均荧光强度值。MMP与平均荧光强度值正相关。

6.线粒体ATP产量检测：将各组细胞常规消化，用254培养基重悬，使用细胞计数板计数，每组各取4 500个细胞进行下一步实验。向细胞中加入2%三氯乙酸50 μl/管，室温静置10 min后向管中加入50 μl 4%三羟甲基氨基甲烷中和，1 000×g离心3 min，取上清液。使用Enliten®ATP检测试剂盒，用荧光素酶报告系统检测RLU值。用试剂盒中ATP标准品设立ATP浓度梯度RLU值，建立RLU值-ATP浓度的标准曲线，按照拟合公式计算各样品ATP含量。

7.统计学方法：用graphpad prism 5软件进行数据分析。mRNA表达水平比较、mtDNA拷贝数、MMP、ATP含量比较采用两样本t检验进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Nrf2基因全长过表达质粒瞬时转染PIG3V细胞体系的建立

转染后24 h在倒置荧光显微镜下观察，对比白光和蓝光激发后图像（图1）。转染后的细胞胞质内呈现颗粒状绿色荧光，胞核部位不显示荧光，提示质粒转染成功。

二、Nrf2过表达对线粒体合成相关基因mRNA和蛋白水平的影响

Nrf2过表达质粒转染PIG3V细胞后24 h，过表达组Nrf2 mRNA、NRF1 mRNA水平均较对照组明显升高（均P＜0.001），而TFAM mRNA水平较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。48 h后Nrf2 mRNA、TFAM mRNA水平较对照组升高（均P＜0.05），而NRF1 mRNA水平较对照组差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。Western印迹法结果显示（图 2），转染后 24 h 时，过表达组 Nrf2、NRF1、TFAM蛋白表达与对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）；48 h 时，过表达组 Nrf2、NRF1、TFAM 蛋白均较对照组明显升高（P＜0.05）。见表2。

三、Nrf2过表达后细胞相对mtDNA拷贝数变化

图1 转染质粒后细胞荧光图（×400）：本质粒带绿色荧光，成功转染的细胞在蓝光激发下，胞质呈现绿色颗粒状荧光，胞核无荧光 1A：pEX-1空质粒组白光下图像；1B：pEX-1空质粒组蓝光激发下图像；1C：转染pEX-1-Nrf2过表达质粒组白光下图像；1D：转染pEX-1-Nrf2过表达质粒组蓝光下图像

转染后24 h，过表达组相对mtDNA拷贝数（0.247±0.172）与对照组（0.515±0.422）相比差异无统计学意义（t=0.820，P=0.473）；转染后 48 h，过表达组（8.167±1.620）高于对照组（2.779±0.013），差异有统计学意义（t=5.760，P=0.005）。

表1 黑素细胞过表达Nrf2后相关基因mRNA相对表达量（2-ΔΔCt，±s）

表1 黑素细胞过表达Nrf2后相关基因mRNA相对表达量（2-ΔΔCt，±s）

注：n=4。Nrf2：核因子E2相关因子2；NRF1：核呼吸因子1；TFAM：线粒体转录因子A

组别 24 h 48 h Nrf2 NRF1 TFAM Nrf2 NRF1 TFAM对照组 1.213±0.571 0.827±0.329 1.433±0.521 1.459±0.203 2.221±1.215 1.194±0.410过表达组 56.216±2.024 33.462±2.921 1.876±0.915 5.625±0.322 2.323±1.332 2.041±0.205 t值 45.301 19.230 0.729 18.956 0.098 3.200 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.507 ＜0.001 0.927 0.033

四、Nrf2过表达后MMP的变化

Nrf2过表达后24 h，过表达组MMP平均荧光强度值（73.974±0.44）较对照组（72.302±0.28）升高2.313%，差异有统计学意义（t=5.546，P=0.005）。48 h后过表达组 MMP（16.537± 0.38）较对照组（14.396±0.21）升高14.872%，差异有统计学意义（t=8.537，P=0.001）。

五、Nrf2过表达后线粒体ATP产量的变化

图2 过表达Nrf2后线粒体合成相关蛋白表达水平的变化1：过表达组；2：对照组。Nrf2：核因子E2相关因子2；NRF1：核呼吸因子1；TFAM：线粒体转录因子A

转染后24 h，Nrf2过表达组ATP含量（1.593±2.122）×10-13mol/细胞与对照组（1.111±0.902）×10-13mol/细胞相比差异无统计学意义（t=0.418，P=0.691）；转染后 48 h，Nrf2过表达组 ATP含量（12.820±0.561）×10-13mol/细胞较对照组（7.437±0.556）× 10-13mol/细胞明显升高 （t=22.040，P=0.008）。

讨 论

稳定期白癜风患者白斑区皮肤内角质形成细胞线粒体肿胀，线粒体嵴崩裂［7］。进展期白癜风患者白斑周边皮肤内黑素细胞线粒体肿胀，线粒体嵴重排；白斑周边皮肤内角质形成细胞中的大部分线粒体内膜、膜间隙和基质肿胀，线粒体嵴重排，而正常对照皮肤相应细胞中线粒体结构正常［3］。线粒体损伤诱导的线粒体凋亡途径是细胞凋亡主要途径之一。因为线粒体损伤后MMP下降，ATP产生减少，膜通透性转换小孔开放，细胞色素C（Cyt-C）释放至胞质，形成Cyt-C/Apaf-1/procaspase-3凋亡复合体，引起procaspase-3激活成凋亡蛋白Caspase-3，进而引起细胞的凋亡［8］。我们前期研究发现，黄芩素可以抑制线粒体Cyt-C释放，从而减少氧化应激诱导的人黑素细胞凋亡，提示改善线粒体功能可提高黑素细胞的抗氧化应激能力［9］。

表2 黑素细胞过表达Nrf2后相关蛋白灰度分析（±s）

表2 黑素细胞过表达Nrf2后相关蛋白灰度分析（±s）

注：n=4。Nrf2：核因子E2相关因子2；NRF1：核呼吸因子1；TFAM：线粒体转录因子A

组别 24 h 48 h Nrf2 NRF1 TFAM Nrf2 NRF1 TFAM对照组 1.092±0.007 0.82±0.045 1.475±0.137 1.207±0.017 1.165±0.034 1.208±0.011过表达组 1.127±0.022 0.836±0.033 1.480±0.056 1.717±0.852 1.589±0.089 1.879±0.051 t值 1.530 0.293 0.032 5.870 4.464 12.850 P值 0.201 0.784 0.976 0.004 0.011 ＜0.001

研究发现，Nrf2可直接调节小鼠神经元和成纤维细胞线粒体呼吸作用，上调Nrf2后MMP升高，ATP生成增加，氧化磷酸化效率提高［10］。本研究在白癜风患者黑素细胞中观察到，过表达Nrf2后，MMP升高，细胞内ATP含量增加，与文献报道结果类似［10］。在心肌细胞中，Nrf2入核与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）启动子区域结合，使NRF1上调，上调的NRF1促进TFAM表达，TFAM使线粒体合成增加［6］。本研究发现，在转染Nrf2过表达质粒后24 h，NRF1 mRNA即明显升高，而TFAM mRNA无明显变化；在48 h后NRF1 mRNA降至正常水平时，TFAM mRNA却明显升高。TFAM mRNA升高滞后于NRF1 mRNA升高的现象，提示NRF1是作为上游基因调控TFAM的升高，与小鼠肝脏细胞、心肌细胞内的研究结果一致［5-6］。

Nrf2通路是细胞内抗氧化应激的主要通路。Nrf2在合成后与Keap1结合而处于无功能状态，在ROS的作用下其与Keap1解离，进而被磷酸化而激活。磷酸化的Nrf2发生核转位，与ARE相结合，促进一系列的抗氧化基因的表达，NRF1就是其中之一。NRF1上调后进一步促进TFAM表达，进而使线粒体生物合成增加，功能障碍改善。另外，Nrf2基因可被 PI3K、PKC、JNK、ERK、P38 等信号分子激活［11-12］。我们前期研究发现，过表达Nrf2可对氧化应激作用下人黑素细胞发挥保护作用，并且我们证实血红素单加氧酶-1（heme oxygenase，HO-1）等抗氧化因子的上调是其发挥保护作用的机制［12-13］。作为细胞内作用广泛的转录因子，Nrf2保护黑素细胞的机制可能不仅限于此。通过本实验我们证实，在白癜风黑素细胞中Nrf2改善线粒体功能，间接抑制线粒体凋亡途径，可能是其抗氧化应激作用的另一重要机制。

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2014-10-15）

（本文编辑：颜艳）

Effects of up-regulation of NF-E2-related factor 2 on mitochondrial biosynthesis and function in an immortalized human vitiligo melanocyte cell line PIG3V

Zhu Longfei,Tian Jun,Jian Zhe,Liu Bangmin,Xiao Qian,Li Chunying,Gao Tianwen.Department of Dermatology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China

Gao Tianwen,Email：gaotw@fmmu.edu.cn

ObjectiveTo explore the effects of NF-E2-related factor 2（Nrf2）overexpression on mitochondrial biosynthesis and function in melanocytes.MethodsAn immortalized human vitiligo melanocyte cell line PIG3V was used in this study.An overexpression plasmid Nrf2-pEX-1 containing the full-length Nrf2 gene was constructed.PIG3V cells were divided into 3 groups：blank group receiving no treatment,control group transfected with the pEX-1 plasmid,overexpression group transfected with the Nrf2-pEX-1 plasmid.After transfection,real-time quantitative reverse transcription-PCR （RT-PCR） and Western blot were performed to determine the mRNA and protein levels of mitochondrial biosynthesis-related factors（including Nrf2,nuclear respiratory factor 1 （NRF1）and mitochondrial transcription factor A （TFAM））respectively;RT-PCR was also conducted to measure the copy number of mitochondrial DNA（mtDNA）,and flow cytometry to estimate mitochondial membrane potential（MMP）;luciferase reporter system was used to estimate the intracellular adenosine triphosphate（ATP）level.Statistical analysis was carried out by using a twosamplet-test.ResultsAfter transfection,a significant increase was observed in the mRNA expression levels of Nrf2 and NRF1 at 24 hours（bothP＜0.001）and in those of Nrf2 and TFAM at 48 hours（bothP＜0.05）,but no significant change was noted in the mRNA expression level of TFAM at 24 hours（P＞0.05）or in that of NRF1 at 48 hours（P＞0.05）in the overexpression group compared with the control group.In the case of Nrf2,NRF1 and TFAM protein levels,the overexpression group showed significant increases compared with the control group at 48 hours after transfection（allP＜ 0.05）,while no significant difference was noted between the two groups at 24 hours.Compared with the control group,MMP in the overexpression group increased by 2.313%at 24 hours（t=5.546,P=0.005）and by 14.872%at 48 hours（t=8.537,P=0.001）after transfection.Both the relative copy number of mtDNA and ATP level were similar between the overexpression group and control group at 24 hours after transfection （bothPgt;0.05）,but significantly higher in the overexpression group than in the control group at 48 hours （t=5.760,P=0.005;t=22.040,P=0.008）.ConclusionUp-regulation of Nrf2 pathway can improve mitochondrial function and biosynthesis in PIG3V cells likely by promoting the expressions of mitochondrial biosynthesis-related genes and proteins.

Vitiligo;Melanocytes;Mitochondria;NF-E2-related factor 2;Adenosine triphosphate

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.06.002

国家自然科学基金面上项目（81373844）；国家自然科学基金青年基金（81102669、81402599）

710032西安，第四军医大学西京皮肤医院

高天文，Email：gaotw@fmmu.edu.cn