生物炭作为EM菌载体影响因素及其条件优化

董金星，杨梦娇，陈小芳，周亚林，周金燕，陶雅圆，崔杰玉，谢 越

(安徽科技学院 资源与环境学院，安徽 凤阳 233100）

EM菌是主要菌种是以乳酸菌、光合细菌、酵母菌、乙酸菌为主的微生物复合而成的一种微生活菌制剂[1]，其作为功能性微生物已经用于养殖业、渔业、污水及废弃物处置等多个方面[2]，但如何使用适当的载体使EM菌充分发挥功效一直是研究的难点。生物炭是生物质在缺氧和相对温度“较低”(＜700℃)条件下热解形成的产物[3－4]，主要由有芳香烃和单质炭或具有石墨结构的炭组成，含有60%以上的碳元素，其作为肥料缓释载体、土壤改良剂、污染物修复、减少碳排放量等方面近些年来受到国内外学者的广泛关注[5－6]。生物炭孔隙度发达和比表面积巨大，可以作为优良的功能性微生物载体[7]。但生物炭作为EM菌的功能性微生物载体方面的研究却鲜见报道，本试验研究了生物炭作为EM菌载体的承载能力，利用平板计数法对其进行研究，优化生物炭投加量、菌液浓度、振荡时间、吸附温度等关键影响因子，探讨生物炭作为功能性微生物载体的可行性和最佳条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

生物炭:所用生物炭为自制稻壳生物炭，将稻壳放入刚玉坩埚内压紧加盖，用铝箔纸包裹严实后放入马弗炉内，500℃下烘制2h，即制得稻壳生物炭[8]。EM 菌培养基组成为:红糖100g，尿素1g，NaCl 1g，1L蒸馏水，溶解后调整pH至7.0±0.2。平板计数琼脂培养基组成:胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15g，1L 蒸馏水，溶解后调整 pH7.0 ±0.2，分装锥形瓶后，121℃高压灭菌灭菌15min[9]。无菌生理盐水:取8.5g NaCl溶于1L蒸馏水中，121℃高压灭菌灭菌15min。EM菌种采购自河南中广集团，菌种为黄褐色干粉状复合型菌剂，由双岐菌、乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌等组成。红糖购于安徽省凤阳县某超市;尿素、NaCl、胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、琼脂等药剂均为分析纯。HZ500L恒温摇床(武汉瑞华仪器设备有限责任公司);GI54T高压灭菌锅(ZEALWAY);DNP－9272－1A恒温培养箱(上海三发科学仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 制备待测EM菌液 将EM菌种干粉接种于EM菌培养基，置于密闭塑料瓶中，36±1℃、200 r/min，每日放气一次，振荡培养48 h，即为活化EM菌液。再将活化EM菌液与EM培养基以体积比1∶19的比例，36℃恒温、160 r/min振荡，每日开盖放气一次，振荡培养72h后即为待测EM菌液。

1.2.2 不同生物炭投加量对 EM 菌吸附效果的影响 各取 0.40g、0.80g、1.20g、1.60g、2.00g、2.40g 生物炭，另取0g记为CK，加入250mL三角烧瓶内，分别加入10mL待测EM菌液和90mL无菌水，25℃、160 r/min振荡30min，取上清液测定EM菌CFU值，以CK的CFU值减去不同处理样品CFU值即为被生物炭吸附的EM菌CFU值，测定方法见1.2.6。每个处理做3个重复。

1.2.3 生物炭对不同浓度EM菌吸附效果的影响 各取10mL待测EM菌，分别稀释2倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍，加入2g生物炭，另取0g记为CK，加入250mL三角烧瓶内，分别加入10mL待测EM菌液和90mL无菌水，25℃、160 r/min振荡30min，取上清液测定EM菌CFU值，以CK的CFU值减去不同处理样品CFU值即为被生物炭吸附的EM菌CFU值，测定方法见1.2.6。每个处理做3个重复。

1.2.4 不同振荡时间生物炭对EM菌吸附效果的影响 各取10mL待测EM菌、40mL无菌水，分别加入6 个250mL 三角烧瓶内，加入2g生物炭，25℃、160 r/min 振荡 0min、30min、60min、90min、120min、150min，另取0g记为CK，加入250mL三角烧瓶内，取上清液测定EM菌CFU值，以CK的CFU值减去不同处理样品CFU值即为被生物炭吸附的EM菌CFU值，测定方法见1.2.6。每个处理做3个重复。

1.2.5 不同温度下生物炭对EM菌吸附效果的影响 各取10mL待测EM菌、40mL无菌水，分别加入5个250mL三角烧瓶内，加入2g生物炭，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，160 r/min振荡60min，另取0g记为CK，加入250mL三角烧瓶内，取上清液测定EM菌CFU值，以CK的CFU值减去不同处理样品CFU值即为被生物炭吸附的EM菌CFU值，测定方法见1.2.6。每个处理做3个重复。

1.2.6 EM菌CFU值测定方法 在超净工作台内以无菌操作将待测样取1mL用无菌生理盐水稀释至104、105两个稀释倍数，各取1mL分别加入无菌培养皿内，每皿加入15mL～20mL尚未凝固的平板计数琼脂，混匀，凝固后在琼脂表面再覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL)，凝固后翻转平板，36±1℃培养48h±2h后记录稀释倍数和相对应的菌落数量，即为菌落形成单位(以CFU表示)。

1.3 最佳吸附效果选择

在单因素实验的基础上，以生物炭投加量、EM菌浓度、振荡时间、吸附温度4个条件作为参考因素，设计正交设计因素与水平考察，见表1。

表1 正交设计因素与水平考察表Table 1 Orthogonal design factor and level survey

1.4 数据处理

数据分析采用Excel 2007和SPSS 19.0数据处理系统完成。

2 结果与分析

2.1 最佳吸附条件的确定

2.1.1 投加生物炭量的确定 试验1设计单因素变量为生物炭投加量，加入不同重量生物炭吸附处理后，取上清液稀释至合适倍数，分别接入计数培养基，经过48h培养后进行CFU计数，从图1可知，生物炭吸附的EM菌的数量随着生物炭的增加而增加，加入2.4g生物炭吸附的EM菌CFU数量最多，达到2.9×107CFU，相比投加量为0.4g时吸附的EM菌数量增加了93.3%，生物炭投加量与EM菌吸附量呈正相关性。当生物炭投加量0.4g时，其吸附的CFU数为1.5×107CFU，但当投加量增加一倍至0.8g时，其吸附的CFU仅为1.7×107CFU，增幅仅为13.3%。根据图2可知，单位生物炭吸附效果最好的是加入0.4g时，其吸附量为3.8×107CFU/g。随着生物炭投加量的增加，单位生物炭吸附量在投加至2.4g时逐渐减少为1.2×107CFU/g。由投加量0.4g增加至0.8克时，其单位生物炭吸附量大幅降低43.3%，但此后降幅显著减小，当投加量从2.0g提升至2.4g时，单位生物炭吸附量仅降低7.1%，生物炭投加量与单位生物炭吸附量呈负相关。

2.1.2 菌液浓度确定 试验2设计单因素变量为不同浓度EM菌，原EM菌液浓度为4.5×107CFU/mL，加入不同倍数纯水稀释处理后，取上清液稀释至合适倍数，分别接入计数培养基，经过48h培养后进行CFU计数。由图3可知，生物炭吸附效果最好的是稀释2倍，生物炭可吸附的EM菌达到2.3×107CFU/g，随着菌液浓度的降低吸附效果降低，当稀释至20倍时，生物炭吸附量仅0.3×107CFU/g，仅为稀释2倍时的10%。稀释倍数与EM菌吸附量呈负相关。刘庆莉[10]等人研究根瘤菌在草炭和蛭石作为载体试验中发现，以草炭和蛭石作为根瘤菌载体，低浓度的根瘤菌液接入更能发挥作用，而以液体作为根瘤菌载体，根瘤菌接入浓度较高才能发挥作用。

2.1.3 振荡时间的确定 从图4可知，试验3设计单因素变量为不同振荡时间，当振荡时间为0min时，吸附EM菌仅为0.3×107CFU/g，150min生物炭吸附的EM菌已达到2.9×107CFU/g，振荡30min较振荡0min生物炭吸附的EM菌增加了463%，但随着振荡时间的增加，振荡90min后吸附量增加已不显著，振荡150min较振荡120min吸附量仅增加3.2%，振荡120min较振荡90min吸附量仅增加4.5%。其原因是生物炭表层有着大量多空隙结构和特殊结构的官能团，孔道效应也较明显，利于吸附过程的进行。在吸附过程初期，吸附效率较为迅速，但随着吸附时间增加，EM菌大量聚集在生物炭的微孔和表面，使得生物炭吸附位不断减小，因此吸附速率逐渐降低。此前已有许多学者对振荡吸附时间作过研究，沈岩柏[11]等人研究当吸附载体为硅藻土时，振荡20min时已达稳定状态，马万征[12]等研究当活性炭吸附含铬废水时，150min可达稳定状态，而戴世华[13]等人研究的使用活性炭脱色工艺研究在70min即可达到最佳。本研究与其可能由于试验载体材质的不同，振荡90min后基本达到稳定状态。

2.1.4 吸附温度的确定 试验4单因素变量为不同吸附温度，从图5可知，当吸附温度为15℃时，生物炭吸附的EM菌仅为1.8×107CFU/g，当吸附温度上升至35℃时，生物炭吸附量达最大值2.6×107CFU/g，生物炭吸附量提高了44.4%。但当吸附温度上升至40℃时，生物炭吸附量降低为2.3×107CFU/g，降幅为11.5%，其原因可能为有部分EM菌超过35℃后开始死亡。此前许多学者对吸附温度与吸附量对菌群的影响进行研究，沈岩柏[12]等人的研究硅藻土对诺卡氏菌的吸附作用，室温下即可达到较好的吸附效果，但与赵颖[14]等人研究EM菌则在35℃时生长状态最佳，其原因可能因载体或菌种不同其对吸附温度产生的差异表现。

2.2 最佳吸附条件的选择

根据单因素试验结果，并考虑到在实际应用过程中对EM菌群最大总吸附数量的要求，选取1.6g、2.0g、2.4g作为正交试验3个因素水平;选取稀释2倍、稀释4倍、稀释5倍作为正交试验的个因素水平;选取60min、90min、120min作为正交试验3个因素水平，选择30℃、35℃、40℃作为正交试验的3个因素水平，以正交因子水平表设计正交实验表L9(34)，见表2。

表2 正交试验结果表Table 2 Orthogonal experimental results tables

由表2的极差分析可知，4个因素中对生物炭吸附EM菌效果的影响大小主次顺序依次为:A＞B＞C＞D，即生物炭投加量(A)＞菌液浓度(B)＞振荡时间(C)＞吸附温度(D)，生物炭投加量和菌液浓度对生物炭吸附EM菌影响较大。由正交试验K值可推导出，最优吸附条件为A3B1C3D3，但与正交试验表中最优吸附条件A3B1C3D2不相符，对组合A3B1C3D3进行重复试验，其吸附的生物炭为3.8×107CFU/g，大于正交试验中组合A3B1C3D2的3.6×107CFU/g，因此生物炭吸附EM菌最佳吸附条件为A3B1C3D3，即生物炭投加量2.4g、菌液稀释倍数2倍、振荡120min、吸附温度40℃、生物炭吸附的CFU值最高达到3.8×107CFU/g。

3 结论与讨论

目前对生物炭吸附重金属的研究较多，但对其作为吸附EM菌的载体研究鲜见报道。本文研究生物炭作为EM菌载体，生物炭投加量、菌液浓度、振荡时间、吸附温度等四个影响因素对其吸附效果的影响，获得如下结论:生物炭对EM菌有良好的吸附效果，生物炭吸附EM菌量与生物炭投加量呈正相关，但其吸附效率与生物炭投加量呈负相关;与EM菌的浓度呈正相关;与菌液稀释倍数呈负相关;与振荡吸附时间呈正相关，与吸附温度在15℃到35℃内呈正相关，但温度达到40℃吸附效率有所降低。根据正交实验结果可知，生物炭吸附EM菌主要影响因素为生物炭投加量＞菌液浓度＞振荡时间＞吸附温度;吸附10mL浓度为4.5×107CFU/mL的EM菌液其最佳条件为生物炭投加量2.4g、菌液稀释倍数2倍、振荡120min、吸附温度40℃。本研究结果揭示了生物炭可以作为EM菌剂优良载体，具有潜在应用价值。

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