中空纳米二氧化硅复合微球的制备及其对蛋白的亲和分离

田淑芳 邹雪艳 卢海涛 何建英 陈丹云 赵彦保 郭静玉

中空纳米二氧化硅复合微球的制备及其对蛋白的亲和分离

田淑芳1,2邹雪艳＊,2卢海涛3何建英1陈丹云1赵彦保2郭静玉1

(1河南大学化学化工学院，开封475004)
(2河南大学特种功能材料重点实验室，开封475004)
(3河南大学民生学院，开封475004)

利用水热法合成了中空巯基纳米二氧化硅微球(SiO2-SH)，然后在其表面修饰亚氨基二乙酸基团(-IDA)，形成了中空SiO2-SH/IDA双功能化纳米微球。利用该纳米微球表面的-SH和-IDA双功能团，可以更多的吸附溶液中的Ni2+，形成SiO2-SH/IDA-Ni2+复合微球从而可以更好的分离以六聚组氨酸为标签的(His-tagged)蛋白。结果显示制备的样品对分离His-tagged蛋白具有广谱性，并且具有较好的再生能力。

中空微球；SiO2；蛋白分离；功能化；亲和

近年来，随着纳米技术的迅速发展，具有新颖拓扑结构的纳米粒子引起了人们的极大兴趣[1-3]。其中，中空二氧化硅材料因其具有大比表面积、高热稳定性和规则孔道结构等优点在催化吸附、分离提纯、生物材料、纳米材料、环境、能源等领域显示出广泛的应用前景[4-6]。特别是无机氧化物(如TiO2、 SiO2、Fe3O4等)中空微球[7-9]，因密度低、热力学稳定性高等特性备受关注。但在实际应用中，仅仅依靠介孔材料骨架二氧化硅的性能还远远不能满足要求，需要对其表面及孔道进行功能化处理[10-12]。镍离子亲和层析法(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)随之出现[13-16]，它的主要原理为六聚组氨酸链(His-tagged)对某些金属离子(如Ni2+、Cu2+和Co2+)具有亲和能力，能够特异性的固定这些离子，从而达到亲和分离的目的。His-tagged蛋白很容易通过微生物细胞进行表达[17-18]，并且通过适当处理，可实现表面修饰金属离子的再生[19-20]。尽管如此，这些合成方法仍有一定的局限性：通过多步嫁接方式很难获得高密度的功能化基团，从而导致有限的比表面积和较低的表面金属离子浓度，最终导致低的蛋白质纯化效率。

为了较好的解决这个问题，本文采用一步法直接合成了中空巯基纳米二氧化硅微球(SiO2-SH)，并在其表面修饰-IDA基团，使之成为SiO2-SH/IDA双功能团复合材料，大大提高了表面Ni2+的吸附量。同时由于中空SiO2-SH本身具有较高的比表面积，从而用之分离蛋白具有更大的优势。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

巯基丙基三甲氧基硅烷(MPS，95%)购自Alfa-Aesar公司；正硅酸乙酯(TEOS)购自天津市福晨化学试剂厂；十六烷基三甲基氯化铵(CTAC，≥98.0%)购自国药集团化学试剂有限公司；三乙醇胺(TEA，≥99.0%)，亚氨基二乙酸(IDA，98%)，3-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)均购自阿拉丁公司；十六烷基三甲基氯化铵(CTAC，≥99.0%)均购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器

样品的形貌及组成用透射电子显微镜(TEM，JEOL JEM-2010型，日本电子株式会社)，傅立叶变换红外光谱仪(FT-IR，AVATAR360型，美国尼高力公司)，热重分析仪(TG，TGA/SDTA851e，Merrler-Toledo Instruments公司)进行检测；捕获的Histagged蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(SDS-PAGE，Power PAC 300，郑州宝赛科贸有限公司)，稳压电压是70 V，分离电压是120 V。捕获蛋白的含量用紫外-可见分光光度计(UV-Vis，nanodrop 2000c，美国Thermo公司)进行测定，测定波长为400 nm。

1.2 实验步骤

1.2.1 SiO2-SH的制备

在50 mL烧瓶中加入17 mL水，2.8 mL无水乙醇，0.03 g CTAC，搅拌10 min后加入1.1 mL TEA，继续搅拌20 min后升温至60℃，加入1.4 mL TEOS和1.4 mL MPS的混合物，继续反应3 h。得到的产物转入50 mL高压反应釜中，于110℃反应48 h，自然冷至室温。离心后沉淀用盐酸乙醇溶液洗涤3次。最后用无水乙醇洗涤3次后于60℃烘干，即得到SiO2-SH样品。

1.2.2 SiO2-SH/IDA的制备

称取1.7 g IDA，加入20 mL去离子水溶解在烧瓶中，然后用NaOH调节溶液的pH值为11，在0℃冰浴条件下，边搅拌边加入2 mL GPTMS，随后将溶液加热至65℃，反应12 h。取3 mL GPTMS-IDA溶液将其pH值调制为2，加入0.1 g SiO2-SH微球，分散后升温至90℃反应3 h，溶液离心、洗涤后得到SiO2-SH/IDA样品。

1.2.3 SiO2-SH/IDA微球吸附Ni2+

准确称取3 mg SiO2-SH/IDA样品，分散在50 mL的2 mol·L-1NiCl2溶液中，于25℃水浴震荡反应2 h，之后沉淀用去离子水洗涤6次，分散在1 mL 25%的乙醇中备用，即得SiO2-SH/IDA-Ni2+样品。

1.2.4 SiO2-SH/IDA-Ni2+微球对His-tagged蛋白的分离

文中分离的蛋白为His-tagged Thioredoxin(Histagged TRX)[20]，来自于PET-32a质体[21]，六聚组氨酸为标签的重组质体被植入大肠杆菌体内，并用常规的方法进行蛋白的表达[22]。一般来说，所有Histagged融合蛋白都可以用亲和分离的方法捕获分离。蛋白分离的具体步骤如下：首先用1 000μL破菌buffer(20 mmol·L-1Tris-HCl，含0.2 mol·L-1NaCl)洗涤SiO2-SH/IDA-Ni2+复合材料，然后将这些复合材料分散到1 500μL细胞裂解液中，在摇床上(90 r· min-1)4℃孵育2 h。随后，将捕获了目标蛋白的复合材料用破菌buffer离心洗涤数次以去除表面残留的蛋白。最后，捕获的His-tagged TRX蛋白用一定浓度的300μL咪唑进行洗脱，取适量洗脱后的蛋白进行SDS-PAGE分析。

2 结果与讨论

2.1 TEM分析

图1为制备样品的TEM图，从图中可以看出，制备的样品为中空微球，内部有多处中空，样品粒径均一，分散性好，平均粒径为90 nm，壳层较厚。

图1 制备SiO2-SH样品的TEM图Fig.1 TEM image of the prepared SiO2-SH sample

2.2 FT-IR分析

图2给出了所制备的SiO2-SH/IDA样品的FTIR图。从图中可以看出，1 124、801和471 cm-1均有明显的红外吸收峰，归因于Si-O-Si的反对称及反对称伸缩吸收峰和弯曲振动吸收峰，说明该样品的主要成分为SiO2[23-24]。2 550 cm-1处的强峰对应微球中-SH基团的伸缩振动[25]，说明制备的样品中含有-SH基团。2 926 cm-1为亚甲基的伸缩振动峰，这可能是由于引入-SH或-IDA基团引起的。对比图2b中SiO2-SH(曲线1)和SiO2-SH/IDA(曲线2)的变化可以看出，曲线2在1 623 cm-1处增加了-NH及COO-的伸缩振动峰，1 528 cm-1处增加了N-HⅡ的面内弯曲振动吸收振动峰[26]，说明制备样品的表面成功修饰了-IDA基团。

图2 (a)SiO2-SH/IDA的样品的FT-IR图；(b)制备SiO2-SH和SiO2-SH/IDA样品的FT-IR图Fig.2(a)FT-IR spectrum of the parpared SiO2-SH/IDA sample;(b)FT-IR spectrum of the preparedSiO2-SH and SiO2-SH/IDA samples

2.3 TG曲线

图3为制备SiO2-SH和SiO2-SH/IDA样品的TG图，从图中可以看出样品从室温～800℃均有明显的失重，其中室温～240℃为表面吸附水的失重，而主要的失重出现在240～800℃，从曲线1可以看出样品SiO2-SH的失重率约为37.9%，这主要为表面巯基的失重率。从曲线2可以看出，样品SiO2-SH/IDA的失重率为41.7%，这主要是由于表面修饰的-SH和-IDA基团的热分解所致，说明表面具有较高的官能团密度。对比两条曲线可以看出，曲线2比曲线1多失重约3.8%，这可能是由于表面-IDA基团的热分解所引起的。

图3 制备SiO2-SH和SiO2-SH/IDA样品的TG曲线Fig.3 TG curve of the prepared SiO2-SH and SiO2-SH/IDA samples

2.4 捕获蛋白测评

亲和分离是一种常规分离蛋白的方法，它的基本原理是利用载体表面的基团与蛋白质进行特异性结合，从而达到分离目标蛋白的效果。从图4可以看出，样品从制备到分离His-tagged目标蛋白共需要4步：首先水热法一步合成中空SiO2-SH微球，随后在微球表面修饰-IDA基团形成SiO2-SH/IDA，并用其来吸附Ni2+，从而形成SiO2-SH/IDA-Ni2+复合微球，最后将制备的微球直接用于混合蛋白的分离，可将His-tagged融合蛋白从混合蛋白中分离提纯。其可能的作用机理为，-SH和-IDA基团对溶液中的Ni2+具有协同作用，可以吸附更多的Ni2+，从而增加表面离子密度，进而更好的分离His-tagged融合蛋白。而传统的材料中一般只有一种金属螯合基团，如-IDA、-NTA(氨基三乙酸)、-CM-ASP(羧甲基天冬氨酸)[27-28]。

图4 制备样品及分离目标蛋白示意图Fig.4 Scheme of the synthesis of the sample and separation of the target protein by the prepared sample

为了确定最佳的咪唑洗脱浓度，我们考察了不同浓度洗脱条件下制备的SiO2-SH/IDA-Ni2+复合微球分离His-tagged TRX蛋白的效果，图5为不同咪唑浓度洗脱下制备微球分离目标蛋白的SDS-PAGE电泳图,泳道1：混合蛋白；泳道2：0.5 mol·L-1;泳道3：1 mol·L-1；泳道4：2 mol·L-1；泳道5：3 mol·L-1。从图中可以看出，当改变咪唑洗脱浓度时，随着咪唑浓度的增加，洗脱目标蛋白的量逐渐增加，当咪唑浓度为1 mol·L-1时，洗脱下来目标蛋白已达到最大，且几乎没有杂蛋白。当继续增加咪唑浓度时(2、3 mol·L-1)，洗脱下来杂蛋白的量也随之增多，因此，我们以下测试选用咪唑的浓度为1 mol·L-1。

为了测试制备样品对目标蛋白的检测限，我们对不同梯度的His-tagged TRX蛋白进行检测。图5泳道6～9为不同His-tagged TRX加入量分离蛋白的SDS-PAGE图：泳道6：His-TRX浓度100μmol· L-1；泳道7：His-TRX梯度10μmol·L-1；泳道8：His-TRX梯度1.0μmol·L-1；泳道9：0.1μmol·L-1。从泳道6～8可以看出，当His-tagged TRX浓度在100～1.0μmol·L-1时，制备的样品对目标蛋白均有较好的检测效果，当蛋白浓度为0.1μmol·L-1时，泳道9的条带较弱，说明样品对目标蛋白的检测能力较弱，即制备样品对His-tagged TRX蛋白的检测限至少为1.0μmol·L-1，具有较好的响应效果。

图5 不同咪唑浓度及不同浓度His-tagged TRX蛋白浓度条件下SiO2-SH/IDA-Ni2+复合微球分离Histagged TRX蛋白的电泳图Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+composite NSs in different concentration of imidazole and different concentration His-tagged TRX proteins were used

泳道10为商品凝胶分离混合蛋白的电泳图，从图中可以看出，文中制备样品分离目标蛋白的效果(泳道2)与商品凝胶分离效果(泳道10)相当，由于商品凝胶分离蛋白需要多次过柱子，操作比较繁琐，所以与之相比，制备样品分离目标蛋白的操作更简便、快捷。

为了考察制备SiO2-SH/IDA-Ni2+复合微球的再生能力，我们用EDTA和NiCl2溶液对分离过Histagged TRX蛋白的微球进行处理，然后再用其分离混合蛋白。图6中泳道1为Marker，泳道2为混合蛋白，泳道3～5分别为第一次再生、第二次再生、第三次再生后复合微球对His-tagged TRX蛋白分离的电泳图。从图6可以看出，制备的微球再生3次，仍对混合蛋白中His-tagged TRX蛋白具有较高的分离能力(泳道3～5)，说明此微球具有较强的再生能力。

为了考察制备的SiO2-SH/IDA-Ni2+复合微球分离His-tagged融合蛋白的广谱性，我们又考察了SiO2-SH/IDA-Ni2+微球对His-tagged Light Oxygen Voltage(His-tagged LOV)蛋白的分离效果，图7中泳道1为制备的SiO2-SH/IDA-Ni2+样品从混合蛋白中分离His-tagged LOV蛋白的电泳图，泳道2为混合蛋白，泳道3为Marker。从图7可以看出，制备的样品对His-tagged LOV蛋白仍具有较好的特异性分离效果，能够从混合蛋白中将目标蛋白分离出来，说明制备的SiO2-SH/IDA-Ni2+样品对His-tagged的蛋白具有广谱性[29]。

图6 SiO2-SH/IDA-Ni2+复合微球循环分离His-tagged TRX蛋白的SDS-PAGE图Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified His-tagged TRX proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+NSs for four times

图7 SiO2-SH/IDA-Ni2+复合微球分离His-tagged LOV蛋白的SDS-PAGE图Fig.7 SDS-PAGE analysis of purified His-tagged LOV proteins by the prepared SiO2-SH/IDA-Ni2+NSs

3 结论

本文中，我们通过一步法直接制备了中空巯基二氧化硅纳米微球，然后在其表面修饰-IDA基团，并用其吸附Ni2+，从而形成SiO2-SH/IDA-Ni2+纳米微球。利用该微球可以有效的分离His-tagged融合蛋白，操作简便快捷，对目标蛋白检测灵敏度高，并且通过再生处理，可实现微球的多次循环利用，具有潜在的市场价值。与商品凝胶分离介质相比，分离目标蛋白操作更简便、快捷。

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Synthesis of Nanometer Hollow Silica Composite Microspheres for Affinity Separation of Protein

TIAN Shu-Fang1,2ZOU Xue-Yan＊,2LU Hai-Tao3HE Jian-Ying1
CHEN Dan-Yun1ZHAO Yan-Bao2GUO Jing-Yu1
(1College of Chemistry and Chemical Enginerring,Henan University,Kaifeng,Henan 475004,China)
(2Key Laboratory for Special Functional Materials,Henan University,Kaifeng,Henan 475004,China)
(3Henan University Minsheng College,Kaifeng,Henan 475004,China)

Hollow silica nanospheres with thiolgroups(SiO2-SH NSs)have been successfully prepared through a hydrothermal route.Then the SiO2-SH NSs was further modified by conjugating iminodiacetic acid(IDA)to bear dual chelating groups(-SH and-COOH).After chelating Ni2+,these hollow NSs with dual chelating groups were applied to purify histidine-tagged(His-tagged)proteins.Results show thatthese hollow NSs can be widely used to separate His-tagged proteins and have a good reused ability.

hollow microspheres;silica;separation of protein;functionalization;affinity

O613.72

A

1001-4861(2015)07-1329-06

10.11862/CJIC.2015.191

2015-01-24。收修改稿日期：2015-04-25。

河南省教育厅科学技术重点研究项目(No.14B150003)，国家自然科学基金(No.21271062)资助项目。

＊通讯联系人。E-mail：zouxy182838@163.com