超高效合相色谱对芳樟醇对映体的拆分及热力学研究

王 波，闫 衡，王肃军，刘阿静，杨盛鑫，周 围，，*

(1．甘肃出入境检验检疫局 综合技术中心，甘肃 兰州 730000;2．甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070;3．西北师范大学 地理与环境科学学院，甘肃 兰州 730070)

手性是自然界普遍存在的现象，随着科学的发展，对光学纯物质的需求量越来越大，手性对映体分离日益引起人们的关注。近年来手性香精香料的研究与开发已成为世界各大香精香料公司主要开发的方向和焦点之一［1］。因此研究手性化合物的分离对于手性香精香料的开发具有非常重要的意义。

芳樟醇(Linalool)又名沉香醇、芫荽醇、里那醇等，学名为3，7-二甲基-1.6-辛二烯-3-醇，分子式为C10H18O，分子量154.24，属于链状萜烯类，具有铃兰香气，几乎不溶于水和甘油，溶于丙二醇、非挥发性油和矿物油，混溶于乙醇和乙醚，具有左旋和右旋两种光学异构体。在不同来源的精油中，多为异构体混合物，消旋体存在于香紫苏油、茉莉油和合成芳樟醇中，右旋体存在于芫荽油、某些品种的香紫苏油中，左旋体存在于芳樟叶油、黄樟油、熏衣草油、玫瑰木油中。当今“芳香疗法”和“芳香养生”广泛使用的各种精油中，芳樟叶油被公认为具有抗抑郁、镇静、抗菌、止痛、松弛肌肉等作用。已有研究表明，左旋体的镇静作用明显，而右旋体则相反，故对芳樟醇进行手性拆分而得到光学纯物质具有重要意义［2－3］。

目前，高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)和超临界流体色谱(SFC)等方法在手性化合物分离领域均发挥着重要作用。其中，HPLC有大量的手性固定相(CSPs)可供选择，是最通用的色谱分离技术。超高效合相色谱法(Ultra performance convergence chromatography，UPC2)除了具有传统超高效液相色谱的优点外，还可与超临界流体色谱技术结合，以超临界流体CO2为流动相主体，依靠流动相的溶剂化能力进行分离分析［4－6］。UPC2能够通过精确调节流动相强度、压力和温度，获得所需的系统分辨率和选择性，可对待测物的保留和分离进行有效调控，与常规的HPLC，GC和SFC技术相比，具有体系重现性及稳定性好、分离效率高等特点，有效弥补了HPLC，GC和SFC在分离手性物质方面的不足。近年来，采用HPLC，SFC技术分离手性化合物的研究已有较多报道［7－16］，对于芳樟醇的拆分也有不少报道［17－21］，但UPC2技术应用于芳樟醇对映体分离尚未见报道。本研究将UPC2技术应用于芳樟醇对映体的拆分，分离过程中有机溶剂的用量极少，是一种快速、简单、环保、高效的分离方法。该研究为芳樟醇手性化合物的分离开拓了一种新途径。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效合相色谱仪(美国Waters公司)，配有Waters EmpowerTM3数据处理系统;MS3涡旋仪(德国IKA公司);CAPCELL PAK Chiral CD－Ph色谱柱(150 mm×3.0 mm，4.6 μm，日本资生堂);移液枪(美国 Thermo Electron 公司，100～1 000 μL，20～100 μL)。

工业芳樟醇(纯度90%，上海申宝香精香料有限公司);CO2(纯度99.997%，兰州汇能公司)，甲醇、乙腈、异丙醇、正己烷(色谱纯，德国Merck公司)。

1.2 标准溶液配制

标准贮备液:精确称取芳樟醇100 μL，用正己烷溶解并定容至100 mL，配成0.1%的标准储备液，4℃下冷藏待用。

标准工作液:准确转移1 mL标准贮备液，用正己烷定容至10 mL，稀释为0.01%的标准工作液，4℃下冷藏待用。

1.3 超高效合相色谱条件

色谱柱:CAPCELL PAK Chiral CD－Ph(150 mm×3.0 mm，4.6 μm);流动相:A为CO2，B为乙腈;流速1.2 mL/min;进样量3 μL;柱温30℃;检测波长215 nm;动态背压(ABPR):1 700 psi。等度洗脱:CO2与乙腈的体积比为97∶3。

2 结果与讨论

2.1 改性剂对分离的影响

由于在超高效合相色谱中，流速对手性化合物的分离基本无影响［22］，故实验流速设为1.2 mL/min。在β-环糊精键合固定相的手性分离中，选择不同的有机改性剂，可以改变对映体分离的选择性。UPC2中有机改性剂通常为甲醇或乙腈。在其它色谱条件不变的情况下，考察流动相分别选择甲醇或乙腈为有机改性剂时对芳樟醇手性分离的影响。结果显示，以甲醇作为有机改性剂时，由于甲醇具有较大的极性，芳樟醇不能得到分离。而乙腈作为有机改性剂时，芳樟醇对映体可得到较好的分离，且峰形尖锐。因此实验选择乙腈作为有机改性剂。

2.2 动态背压(ABPR)对分离的影响

超高效合相色谱中，动态背压(ABPR)也是影响分离过程的重要因素之一，其主要作用是控制CO2在整个操作过程中处于超临界流体状态。在不同的动态背压下，CO2超临界流体对样品有着不同的溶解能力。当背压升高时，超临界流体密度会增大，溶剂化能力增强。实验考察了背压在1 500～2 000 psi范围内时对样品分离度的影响(见表1)。

表1 动态背压对芳樟醇对映体分离的影响Table 1 Effect of active back pressure(ABPR)on separation parameters of linalool

结果显示，当ABPR为1 650 psi时，分离度最大达1.02，随着背压升高至2 000 psi，芳樟醇对映体的分离度逐渐减小。这是由于随着动态背压的升高，CO2超临界流体的密度、黏度随之增加，柱压升高，溶剂化能力改变所致。而1 650 psi时，CO2超临界流体的密度、溶剂化能力最适合芳樟醇对映体的分离。综合考虑保留时间、峰形及色谱柱压力，实验选择动态背压为1 700 psi。

2.3 温度对分离的影响

柱温是影响色谱分离对映体过程的重要因素，柱温的变化不仅影响对映体在固定相上吸附－解离的速度，还会影响对映选择性，甚至可能导致固定相构型发生变化，从而影响溶质与手性固定相间的相互作用，使光学异构体的洗脱次序出现反转。柱温对分离的影响主要有:①随着柱温的升高，超临界流体的密度降低，样品分子的保留增强，容量因子增加;②随着柱温的升高，样品分子的传质速率增加，有助于从固定相表面脱附进入流动相中，容量因子减小［23］。本实验在保持其它色谱条件不变的前提下，考察了柱温在30～55℃范围内变化时对目标物分离的影响(见表2)。从表2可知，芳樟醇对映体的容量因子(k')、分离度(Rs)和选择因子(α)随着柱温升高而逐渐减小，即保留时间缩短，分离效果降低，这说明芳樟醇对映体的分离主要受第二方面的影响。因此，本实验选择最佳柱温为30℃。

表2 温度对芳樟醇对映体分离的影响Table 2 Effect of temperature on linalool separation parameters

2.4 进样量对分离的影响

与传统的超高效液相色谱流动相不同，UPC2主要以CO2超临界流体为流动相，进样量的改变会明显影响CO2超临界流体的溶剂化能力，进而影响色谱峰形及目标物之间的分离度。当芳樟醇体积分数为0.01%时，考察了进样量分别为1，3，5，8，10 μL时的分离效果，结果表明，芳樟醇对映体的分离度随着进样量的增加而减小，且峰形逐渐不对称，当进样量为10 μL时，芳樟醇对映体已无法完成分离。故本实验在芳樟醇体积分数为0.01%时，选择最佳进样量为3 μL。最终确定分离条件为:紫外检测波长215 nm，改性剂为乙腈，流动相流速为1.2 mL/min，柱温30℃，动态背压1 700 psi，芳樟醇体积分数为0.01%时，最佳进样量3 μL;在上述优化条件下，芳樟醇对映体的保留时间分别为1.33 min和1.46 min，总运行时间3 min，图1为芳樟醇对映体的拆分色谱图。

图1 芳樟醇对映体的拆分色谱图Fig.1 Chromatogram of linalool separation

2.5 对映体分离过程中的热力学参数

由色谱图及分离参数可以看出，在对芳樟醇对映体分离的过程中，色谱柱柱温对分离效果有很大影响，对UPC2法分离检测芳樟醇对映体在色谱柱上分离的热力学研究可进一步搜索芳樟醇对映体在色谱柱上的分离保留机理，有助于建立及优化对映体的分离检测条件，并对芳樟醇对映体的进一步研究有着重要意义。利用色谱法分离光学异构体的过程中，溶质的容量因子(k')与柱温的关系以及对映体分离因子(α)与柱温的相关性可用Gibbs－Holmholtz方程(公式1)和Van't Hoff方程(公式2)［24］获得:

式中，k'为溶质的容量因子，ΔH和ΔS分别为保留过程中溶质的焓变和熵变，R为气体常数，T为柱温(K)，φ为相比，Δ(ΔH)和Δ(ΔS)分别为光学异构体间的焓变和熵变的差值。以lnk'或lnα为纵坐标，1/T为横坐标作图，得到Vant't Hoff曲线。芳樟醇对映体lnk'和lnα与1/T的相关性见表3。

表3 芳樟醇对映体lnk和lnα与1/T的相关性Table 3 Relationship between lnk and lnα of linalool and 1/T

由表3可以看出，芳樟醇对映体的lnk'和lnα与1/T之间具有较好的线性关系，这说明在30～55℃范围内柱温的变化对芳樟醇对映体在Chiral CD－Ph手性色谱柱保留机理影响较小。ΔH衡量溶质在固定相上吸附过程的放热情况，反映溶质与固定相的作用力大小。ΔH值越负，说明溶质与固定相的作用越强，与固定相的结合在能量上更有利。ΔS表示溶质吸附过程自由度的变化情况，ΔS越负说明自由度降低越多，分子总体变得更有序。Δ(ΔH)表示两对映体与固定相的作用强度之差，Δ(ΔS)表示自由度变化之差。若Δ(ΔH)和Δ(ΔS)均为负值，说明手性拆分为焓驱动，后出峰异构体较前出峰异构体与固定相存在较强的相互作用，温度升高分离因子下降。若两者皆为正值，说明手性拆分为熵驱动，分离因子和柱效均随柱温的升高而升高。若Δ(ΔH)为负而Δ(ΔS)为正，说明两者对手性识别均有贡献［25－27］。

根据Vant't Hoff曲线可以求出芳樟醇对映体在CAPCELL PAK Chiral CD－Ph色谱柱保留过程中的焓变(ΔH)、焓变差(－Δ(ΔH))、熵变差(－Δ(ΔS))等热力学参数。其中，焓变 ΔH分别为－5 844.08，－8 109.06 J/mol，焓变值均为负，说明芳樟醇与β-环糊精固定相之间的作用较强，属于放热过程。而－Δ(ΔH)为负值(－2 370.24 J/mol)，－Δ(ΔS)为正值(6.60 J/mol)，这说明芳樟醇对映体拆分过程中，既存在熵驱动也存在焓驱动，并以焓驱动为主。

3 结论

本文采用超高效合相色谱对芳樟醇对映体进行分离，考察了有机改性剂、柱温、动态背压和进样量的影响，最终确定分离条件为:紫外检测波长215 nm，改性剂为乙腈，流速为1.2 mL/min，柱温30℃，动态背压1 700 psi，芳樟醇浓度为0.01%时，最佳进样量3 μL。最佳实验条件下的运行时间仅为3 min，能够实现对芳樟醇对映体的基线分离。并对超高效合相色谱分离芳樟醇对映体的热力学进行初步分析，为此类化合物的分离与分析提供了理论基础。

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