小花清风藤水提物体内抗流感病毒的研究

曲新艳，张会敏，张晓娟，史鹏辉，周喆，王升启

1.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850；2.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355

小花清风藤（Sabia parvifloraWall，SPS）为清风藤科清风藤属藤本植物，主要分布于云南、广西、贵州等地。贵州产小花清风藤为布依族、苗族的民间用药，具有清热利湿、祛风止痛的功效，民间俗称小黄药、黄肿药、黄眼药、雅希强，据报道小花清风藤在贵州少数民族地区常用于治疗肝炎，且疗效显著[1]。近年来，对小花清风藤的现代研究陆续有报道，如刘易蓉等发现小花清风藤提取物对小鼠四氯化碳和扑热息痛所致肝损伤有保护作用[2]；杨莹等发现小花清风藤胶囊对小鼠四氯化碳和D-半乳糖所致肝损伤有一定的保护作用[3]。但尚未见有关小花清风藤提取物对流感病毒作用的研究报道[4]。本实验室在筛选抗流感病毒中药的初步研究中发现小花清风藤具有明显的抗流感病毒作用，因此，我们以流感病毒感染小鼠为模型，对小花清风藤水提物体内抗流感病毒作用进行了系统研究。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF 级BALB/c 小鼠，雄性，体重17～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001；甲型流感病毒亚型FM1 小鼠肺适应株（A/FM/1/47）为本实验室保存病毒株。

小花清风藤水提物（取适量小花清风藤药材，粉碎，第一次用8倍量水煎煮40 min，第二次用6倍量水煎煮40 min，合并2 次水煎煮液，浓缩后4℃保存备用）；磷酸奥司他韦（购自武汉贝尔卡生物医药有限公司）；戊巴比妥钠（购自Sigma 公司）；甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）（购自北京普利耐特生物科技有限公司）；TRIzol（购自Sigma公司）。

1.2 小花清风藤水提物对流感病毒性肺炎小鼠生存率、生存时间的影响

取BALB/c 小鼠60 只，随机分成正常组、模型组、磷酸奥司他韦组（i.g，10 mg/kg）、小花清风藤水提物低、中、高3个剂量组（i.g，3.25、6.5、13 g/kg），每组10 只。除正常对照组外，造模前，将冻存的流感病毒于冰上溶解，用4℃冷藏的PBS（pH7.4）将其稀释为每20 μL 含4 个半数致死量（LD50）的稀释液。各组小鼠腹腔注射浓度为1%的戊巴比妥钠进行麻醉后，以4 LD50流感病毒液滴鼻感染，每只20 μL。感染24 h后灌胃（i.g）给药，连续给药3 d，病毒感染对照组以等体积生理盐水灌胃。每日观察小鼠生存状态，连续观察14 d，计算小鼠生存率和平均存活时间[5-8]。

1.3 小花清风藤水提物对流感病毒性肺炎小鼠肺指数的影响

按照1.2 的方法对小鼠进行分组、造模和给药，于造模后第5 d 对小鼠禁食8 h。将小鼠称重并摘眼球放血后脱颈椎处死，取出全肺，用生理盐水洗净并用滤纸吸干后称量肺重，计算肺指数。将左肺浸泡于0.5 mL RNAlater 液中保存于-20℃，右肺固定于0.5 mL福尔马林中[7-9]。

1.4 小花清风藤水提物对流感病毒性肺炎小鼠肺匀浆病毒滴度和肺组织病理改变的影响

称取1.3中RNAlater液浸泡的肺组织50 mg，置于含有0.5 mL TRIzol的EP管（2 mL，无RNase）中，将EP管置于匀浆机中研磨（60 Hz，60 s），TRIzol 法提取肺组织总RNA，用甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）检测肺匀浆病毒滴度。将1.3 中福尔马林固定的小鼠右肺做常规固定、包埋、切片和HE染色后，显微镜下观察小鼠肺组织病理变化[10-12]。

1.5 统计学方法

实验数据以x±s表示，采用t检验进行统计，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 小花清风藤水提物对流感病毒感染小鼠生存率、生存时间的影响

模型组小鼠生存率为10%，平均存活天数为8.4 d；小花清风藤水提物中剂量组生存率和平均存活天数明显升高；磷酸奥司他韦组生存率和平均存活时间接近于正常组。结果见表1。

2.2 小花清风藤水提物对流感病毒感染小鼠肺指数的影响

由图1A 可见，小花清风藤水提物高、低剂量组小鼠的肺指数低于模型组，但是与模型组比较没有显著性差异，提示小花清风藤水提物对流感病毒引起的小鼠肺部炎症有一定的抑制作用。

2.3 小花清风藤水提物对流感病毒感染小鼠肺组织中病毒滴度的影响

由图1B 可见，与正常组比较，模型组小鼠肺组织中病毒滴度显著增高，给药后有所下降，但是与模型组比较没有统计学差异。

2.4 小花清风藤水提物对流感病毒感染小鼠肺组织病理改变的影响

正常组小鼠肺组织肺泡大小一致，肺泡腔内无分泌物，支气管上皮完整，未见炎症细胞浸润，未见肺泡间质炎症；模型组小鼠肺组织大多数静脉、支气管旁出现大量炎细胞浸润，炎细胞大于5层，肺组织间质炎症病变显著，呈片状分布，病变部位大量炎症细胞浸润，肺泡间隔显著增厚，局部肺泡腔内可见大量渗出物，肺泡腔明显缩小，局部严重部位肺泡腔消失；磷酸奥司他韦组小鼠肺组织大多数静脉、支气管旁出现明显炎细胞浸润，但炎细胞较模型组少，局部支气管（及细支气管）旁肺组织间质散在炎症细胞浸润，肺泡间隔轻度增生，间隔轻度增宽，肺泡结构相对正常，炎症累及范围较为有限，仅累及个别支气管（及细支气管）周围肺间质组织；小花清风藤水提物中剂量组偶见静脉、支气管旁袖口装炎症浸润，大多数静脉、支气管旁炎细胞浸润明显，炎细胞1～5 层，局部支气管（及细支气管）旁肺组织间质散在炎症细胞浸润，肺泡间隔轻度增生，间隔轻度增宽，肺泡结构相对正常，炎症累及范围较为有限，仅累及个别支气管（及细支气管）周围肺间质组织。见图2。

表1 小花清风藤对流感病毒性肺炎小鼠生存率、生存时间的影响（n=10）

图1 小花清风藤水提物对流感病毒感染小鼠肺指数（A）和肺组织中病毒滴度（B）的影响

图3 小花清风藤水提物对流感病毒感染小鼠肺组织病理改变的影响

3 讨论

流感是由流感病毒引起的一种急性病毒性呼吸道传染病，严重危害人类生命和健康。流感具有传染性高、传播迅速、周期性暴发和流行的特点。根据流感病毒核蛋白和基质蛋白的抗原性差异，可将流感病毒分为A、B、C 三种类型，又将A 型流感病毒按照血凝素（HA）和神经氨酸苷酶（NA）的抗原性差异分成不同的亚型。抗原变异是流感病毒最显著的生物学特征，这就使得治疗流感病毒的药物和疫苗很难发挥最佳治疗和预防效果，所以研究抗流感病毒药物具有重要意义。目前临床应用的抗流感病毒药物有金刚烷胺、甲基金刚烷胺、病毒唑等，但这些药物出现了耐药性和毒性等问题，而中药在这两方面具有一定的优势和发展前景[13]。

本研究结果表明，小花清风藤水提物（i.g，6.5 g/kg）能提高小鼠生存率30%，并延长小鼠存活时间，降低小鼠肺指数和肺匀浆中病毒滴度，明显改善感染小鼠肺组织炎症病变。这些实验结果提示小花清风藤水提物在体内具有一定的抗流感病毒的作用。

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