星斑川鲽神经肽Y基因cDNA克隆与表达特性研究

郭湘云，李 华，郑风荣，王 波，徐宗军，丁倩倩，赵 盟，李 青

（1.大连海洋大学 水产与生命科学学院，辽宁 大连116023；2.国家海洋局 第一海洋研究所，山东 青岛266000）

神经肽Y（Neuropeptide Y，NPY）是由瑞典科学家Tatenoto K［1］于1982年首次从猪脑组织中得到的一种单链多肽，在结构上，与酪酪肽（Peptide Tyrosine Tyrosine，PYY）和胰多肽（Polypeptide，PP）十分相似，故认为同属胰多肽家族［2－3］。NPY基因包含4个外显子和3个内含子，成熟活性肽由36个氨基酸组成，迄今为止，所研究的脊椎动物发现都含有NPY基因，并且物种之间的NPY保持高度同源性［4－5］。在鱼类的食欲调控因子中，NPY被认为是调控摄食最为关键的因子，而且NPY已经被证实对摄食有明显的促进作用，如金鱼、草鱼等［6－9］。但关于NPY与星斑川鲽摄食的研究还未见报道。

星斑川鲽（Platichthysstellatus）隶属硬骨鱼纲（Osleichthyes），鲽形目（Pleuronectiformes），鲽科（Pleuronectidae），川鲽属（Platichthys），分布于我国黄海中北部海区沿岸，星斑川鲽繁殖力强，性情温驯，适宜于进行集约化养殖，是重要的新型海水养殖经济种类。目前关于调节星斑川鲽摄食的研究多数是调整饲养结构及养殖环境等方面因素，很少有从分子水平上研究星斑川鲽食欲与调控机理及其影响因子，从而揭示其摄食调控和能量代谢关系的研究。本实验以星斑川鲽为材料，克隆了星斑川鲽神经肽NPY基因cDNA序列，并利用Real－time PCR检测了NPY mRNA在星斑川鲽不同组织中的分布情况，并研究了饥饿对NPY在脑组织表达的影响，从而为进一步研究NPY在促进星斑川鲽摄食方面的分子机制而建立一定的分子生物学基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

星斑川鲽取自日照海洋水产资源增殖站，健康养殖鱼共60尾，采样时间为2013－10，体表完好，长约15 cm，重约200g。解剖取鱼的脑组织立即存放于液氮中，备用。

1.2 RNA提取

取正常健康的星斑川鲽的脑组织，采用TRIZOL Reagent（康为世纪）提取总RNA，使用RNase Free DNaseⅠ（TaKaRa）对总RNA进行处理以除去DNA污染，最终定容于无RNase水。用核酸蛋白测定仪测定OD260／OD280比值以检测RNA纯度并计算浓度，同时进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。纯化后的总RNA溶液保存于－80℃。

1.3 NPY cDNA的5′RACE和3′RACE

根据本实验室构建的星斑川鲽脑组织的转录组库中的NPY部分序列，利用Primers 5.0设计引物GSP2、GSP1（表1），以通用引物UPM（universal primer）作为上、下游引物扩增目的片段，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification试剂盒（Clontech）说明书进行反转录、5′RACE扩增和3′RACE扩增。3′RACE程序为：95℃4min；95℃45s，63℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃10min。5′RACE程序为95℃4min；95℃45s，65℃45s；72℃30s，共30个循环；72℃10min。取5μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（生工生物工程有限公司）切胶回收5′RACE产物及3′RACE产物，将PCR产物纯化后连接到PTZ57R／T（Thermo）载体上，转化到感受态细胞E.ColiDH5α中，涂平板、挑菌，经PCR检测阳性克隆后进行扩培，采用试剂盒提取质粒DNA（生工生物工程（上海）有限公司），送上海桑尼公司进行测定序列，将5′RACE和3′RACE获得的基因片段连接为NPY cDNA全长，用引物NPY－F和NPY－R进行全长验证，并与GenBank中已知序列进行比对。

表1 实验使用引物序列Table 1 Sequences of PCR primers

1.4 生物信息学分析与系统进化树的构建

测序结果在NCBI数据库中利用BLAST进行同源性比对；利用DNAstar软件进行序列拼接；用GENSCAN软件确定正确的开放阅读框，并翻译成氨基酸序列；用ProtParam预测理化性质；用PredictProtein预测其二级结构；用获得的星斑川鲽NPY氨基酸序列与其他物种神经肽Y氨基酸序列进行Clustal W比对，然后用 MEGA 5.0软件 Neighbor－joining法（bootstrap values为1 000）进行分子进化分析；利用SOPMA软件进行蛋白质二级结构预测；利用I－TASSER软件进行蛋白质三级结构预测。

1.5 星斑川鲽NPY基因的组织表达及饥饿对其表达影响

采用Realtime PCR法检测NPY mRNA在星斑川鲽不同组织中的相对表达量和在不同饥饿程度时脑组织中的表达水平变化。

取自日照市海洋水产资源增殖站的健康星斑川鲽50尾，运回实验室驯养5d，试验期间海水温度保持在18℃左右，每天换水，充氧。共设置3个试验组，每处理组3组重复，每组重复5尾星斑川鲽，分别在0，24，72h饥饿时间在3组试验鱼中取样，每组随机抽取5尾鱼取其脑组织，使用Prime ScriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis Kit试剂盒（TaKaRa）进行反转录得到cDNA。

根据得到的星斑川鲽NPY cDNA全序列，设计特异性引物Q－NPY F和Q－NPY R，以β－actin作为内参引物（表1）。以各组织RNA和不同饥饿时间的脑组织RNA为模板，采用Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche）进行Real－time PCR程序采用2步法，其中退火和延伸归结为一步：95℃10 min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。

内参基因在各个组织中的表达相对稳定，在检测实验基因的表达水平变化时作为参照物，目的基因的CT值与内参基因的CT值之间的差称为ΔCT，处理组ΔCT与未处理组ΔCT之间的差为－ΔΔCT，2－ΔΔCT值即为样品的该基因的相对表达水平，校准样品恒定为1。利用SPSS16.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），设定差异显著水平P为0.05，当P＜0.05时即差异显著，当P＜0.01时即差异极显著。

2 结果与分析

2.1 星斑川鲽NPY基因cDNA序列序列分析和蛋白质结构预测

2.1.1 星斑川鲽NPY基因cDNA序列序列分析

星斑川鲽NPY基因的核苷酸及推导的氨基酸序列（图1）。利用在线工具GENSCAN（http：∥genes.mit.edu／GENSCAN.html）分析得知：该cDNA全长559bp，5′UTP含有13个碱基，3′UTP含有235个碱基，开放阅读框为210bp，编码69个氨基酸。

2.1.2 星斑川鲽NPY预测蛋白的一级结构分析

利用在线工具ProtParam（http：∥web.expasy.org）分析编码的氨基酸，结果显示其理论分子量为7.98 kDa，分子式为C355H559N95O112S1，总共有1 122个原子组成，预测的等电点（theoretical pI）为5.24，理论推测半衰期（estimated half－life）在哺乳动物网状细胞中为30h，不稳定系数为85.57，可推断为不稳定蛋白，总带正电残基（Arg＋Lys）为9，总带负电残基（Asp＋Glu）为11，总平均亲水性（grand average of hydropathicity）为－0.800，脂肪系数（aliphatic index）为83.48。

表2 星斑川鲽NPY氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of NPY in Platichthys stellatus

图1 星斑川鲽NPY cDNA核酸序列及推导的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of Neuropeptide Y fromPlatichthys stellatus

2.1.3 星斑川鲽NPY预测蛋白的二级结构分析

通过SOPMA软件进行蛋白质结构分析显示，在NPY蛋白质的二级结构中，α－螺旋（Alpha helix）占47.83%，β－转角（Beta turn）占2.90%，无规则卷曲（Random coil）占49.28%（图2）。

图2 SOPMA软件对NPY蛋白二级结构的分析结果Fig.2 Secondary structure of Platichthys stellatus NPY protein analyzed by SOPMA

2.1.4 星斑川鲽NPY预测蛋白的三级结构分析

通过I－TASSER软件预测了星斑川鲽NPY蛋白质的三级结构（图3）。

图3 I－TASSER软件对NPY蛋白三级结构的分析结果Fig.3 Tertiary structure of Platichthys stellatus NPYprotein analyzed by I－TASSER

2.2 星斑川鲽NPY氨基酸的同源性比较及系统进化分析

2.2.1 星斑川鲽NPY氨基酸的同源性分析

将星斑川鲽NPY氨基酸序列与其他物种的NPY氨基酸序列进行BLAST比对，结果表明：星斑川鲽NPY与美国黄盖鲽（Pseudopleuronectesamericanus）的同源性最高，为100%；与鲈形目花鲈（Lateolabrax japonicus）、鰤鱼（Seriolaquinqueradiata）、点带石斑 鱼（Epinepheluscoioides）、军 曹 鱼（Rachycentron canadum）、黑鲷（Acanthopagrusschlegeli）的同源性分别为99%，97%，97%，97%，97%（图4）。

图4 星斑川鲽NPY氨基酸序列与其他物种NPY氨基酸序列的比较Fig.4 Amino acid sequence aligenment of NPY fromPlatichthys stellatus with other fishes

2.2.2 星斑川鲽NPY系统进化树分析

通过MEGA5.0软件构建了星斑川鲽NPY cDNA和氨基酸序列的系统进化树。结果表明：星斑川鲽NPY与鲽形目鱼类的亲缘关系较近，与美洲拟鲽聚为一支，这与上述Blast的分析结果一致（图5，图6）。

图5 星斑川鲽NPY cDNA序列与其他脊椎动物的NPY系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on the cDNA sequences of NPY，showing the relationship between Platichthys stellatus and other known vertebrates

图6 星斑川鲽NPY氨基酸序列与其他脊椎动物的NPY系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of NPY，showing the relationship between Platichthys stellatus and other known vertebrates

2.3 星斑川鲽NPY mRNA的组织分布分析

采用Real time PCR法，以β－actin基因为内参，检测NPY mRNA在星斑川鲽不同组织中的表达分布。结果表明：NPY mRNA在脑、心脏、性腺、肝、肠、肾组织都有表达，但在表达量上有明显差异，心脏和肾组织相对表达量较少。统计分析表明：NPY mRNA在脑、性腺组织中的表达量显著高于其他组织（P＜0.05）；而在肝和肠组织之间的表达差异不显著（P＞0.05）（图7）。

图7 星斑川鲽NPY mRNA在不同组织中的相对表达水平Fig.7 Relative expression level of NPY mRNA in various tissues of Platichthys stellatus

2.4 饥饿对星斑川鲽NPY mRNA表达水平分析

利用Real－time PCR法检测了星斑川鲽NPY在不同饥饿程度时脑组织中的相对表达水平。结果表明：NPY在脑组织中的表达随着饥饿程度的增加而增加，饥饿72h的NPY mRNA相对表达量高于饥饿24h的相对表达量，但差异不显著（P＞0.05）（图8）。

图8 饥饿对NPY mRNA在脑组织中表达的影响Fig.8 Relative expression level of NPY mRNA in brain tissues of Platichthys stellatus

3 讨论

本文通过SMART－RACE技术在星斑川鲽脑组织中扩增出NPY cDNA序列，其蛋白质二级结构中，α－螺旋和无规则卷曲含量相对比较高。α－螺旋构象是相当稳定的、最普遍的螺旋形式，无规则卷曲往往与生物活性相关，对外界的理化因子极为敏感。这表明NPY结构稳定、具有较高的生物活性。

同源性分析比较结果显示，不同物种间NPY存在高度一致性，构建的系统进化树也同样地表明了，星斑川鲽NPY与鲽形目鱼类的亲缘关系较近，与美洲拟鲽聚为一支，这说明了在物种的进化过程中，NPY基因中对于发挥自身功能必须的特定结构，即使经过自然选择，这些结构依旧被保留了下来，而存在些许的差异，可以认为是适应性选择的必然结果。

采用Realtime PCR方法检测了NPY在各组织中的分布情况。结果表明NPY mRNA在脑、心脏、性腺、肝、肠、肾组织均有表达，而且主要在脑组织中表达，该特征与其他硬骨鱼类相同［10－11］。NPY分布在不同的组织可能对应着不同的生理功能，下丘脑是动物摄食的调控中心，表达的NPY可以促进动物摄食；NPY分布在星斑川鲽肠道里，可能参与肠道蠕动和消化吸收的调节；分布在心脏，可能与调节心血管活动有关。

本实验提取不同饥饿处理组的星斑川鲽脑组织RNA，应用Realtime－PCR对NPY mRNA表达量变化进行测定。结果表明：饥饿导致脑组织中的 NPY mRNA表达量升高，这与Lopez－Patino［12］和Silverstein［13－14］的研究结果一致。在对其他鱼类的研究中也得出：食物缺乏会使下丘脑中NPY mRNA的表达量升高，例如斑点叉尾（Ictaluruspunctatus）、冬鳐（Rajaocellata）、巴南牙鲆（Paralichthysorbignyanus）等［15－17］；将NPY重组蛋白通过腹腔注射到罗非鱼（Oreochromissp.）中，可以促进其摄入食物量及其鱼体质量的增加［18］。金鱼饥饿24～72h使下丘脑的NPY mRNA含量呈现时间依存的增加；降低金鱼的食量至正常水平50%，亦使下丘脑的NPY mRNA明显增加［19］。

NPY的促进食欲作用与NPY受体有关。研究表明，NPY的Y1和Y5受体参与NPY对食欲的促进作用［20－22］。大量实验数据证明：NPY生物合成的最初部位主要在下丘脑弓状核（ARC），少部分分布于室旁核（PVN）、背中核（DMN）等区域，弓状核NPY神经元的轴突投射到室旁核，经室旁核分泌NPY与特定的受体Y1或Y5结合，进而参与调节摄食过程。研究显示，在饥饿、剧烈运动、体重降低、泌乳等能量严重消耗情况下，下丘脑中的ARC－PVN路径可被激活，进而增加食欲和摄食量［23－25］。

动物摄食一直是人们研究的重点内容，NPY作为鱼类摄食调节的关键性因子，研究其调节机理具有重要意义，本研究克隆了星斑川鲽的NPY cDNA序列，预测了其蛋白质的二级和三级结构，为在mRNA水平研究NPY生物学功能提供基础，为进一步在蛋白水平上研究星斑川鲽的繁殖发育和遗传育种提供理论基础。

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