岱衢洋与官井洋大黄鱼养殖群体遗传多样性的AFLP分析

娄剑锋，雷世勇，竺俊全＊，吴雄飞

（1.宁波大学 教育部应用海洋生物技术重点实验室，浙江 宁波315211；2.宁波市海洋与渔业研究院，浙江 宁波315012）

大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）隶属鲈形目石首鱼科黄鱼属，为我国重要海产经济鱼类之一。以往因过度捕捞及近海环境污染等原因，自然资源严重衰退。为有效保护大黄鱼资源及发展其增养殖业，1985年福建省率先开展了官井洋大黄鱼人工繁育技术攻关，于1986年获得成功后在全国推广养殖。而浙江岱衢洋大黄鱼的养殖开发相对滞后。由于岱衢洋大黄鱼比官井洋大黄鱼更适宜于浙江海区（特别是舟山、宁波）的养殖条件，而且岱衢洋大黄鱼因体型、体色及肉质与品味俱佳而历来受消费者青睐，养殖开发及市场潜力极大。浙江省高度重视岱衢洋大黄鱼的开发，2008年宁波市岱衢洋大黄鱼养殖开发课题组在岱衢洋海域采捕野生大黄鱼，经保活、驯养达性成熟8尾，以之为亲本繁育与育种。由于种源材料与以往不同，其遗传多样性需要重新认识。

目前对大黄鱼的遗传多样性研究已有较多报道［1－3］。国内学者也通过形态学［4］、RAPD［5］、微卫星［6－7］、ISSR［8］及线粒体基因［9］等方法探讨了岱衢族和闽东族大黄鱼群体间的遗传差异，但利用扩增片段长度多态性技术（AFLP）对其之间的比较研究仅见Hung等［10］报道的闽东族和岱衢族养殖大黄鱼及其杂交子代遗传差异分析。AFLP分子标记技术结合了RFLP的准确性和PCR的高效性，具有信息量大、多态性高、稳定性好、灵敏度高等优点，这体现在对福建官井洋大黄鱼（闽东族）指纹多态性的研究［11］、对人工雌核发育大黄鱼（闽东族）的鉴定及遗传规律分析［12］、对福建闽东地区野生和养殖大黄鱼（闽东族）的种质资源调查［13］，对采捕野生岱衢族大黄鱼的种质分析等［14］。我们运用AFLP技术对岱衢洋大黄鱼（岱衢族）人工繁育二代（F2）养殖群体进行遗传多样性分析，并比较其与官井洋大黄鱼（闽东族）人工繁育多代养殖群体间的遗传差异，以期为岱衢洋大黄鱼的育种提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验用鱼于2012－04取自宁波象山港海区的大黄鱼养殖网箱，岱衢洋大黄鱼养殖群体20尾（以2008年宁波市岱衢洋大黄鱼养殖开发课题组在岱衢洋海域采捕的野生大黄鱼为亲本，于2011－03人工繁育的第二代），个体重80～130g；官井洋大黄鱼养殖群体20尾（以1985－1986年官井洋野捕大黄鱼为亲本多代人工繁育的后代，即2011世代），个体重50～80g。取每尾鱼的少量肌肉组织，分别置于灭菌过的1.5mL冻存管中，放入液氮罐中带回宁波大学实验室，于超低温冰箱中保存。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取

DNA提取参照《分子克隆手册实验指南》［15］。取大黄鱼肌肉组织约100mg，剪碎后加600μL STE裂解液、1μL RNase、5μL蛋白酶K（20mg／mL），56℃水浴1～2h至澄清，然后用改良的酚－氯仿法抽提基因组DNA。紫外分光光度计测定DNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。选取抽提质量较好的DNA模板，并将之稀释至50ng／μL，－20℃保存备用。

1.2.2 AFLP反应

参照Vos等［16］的方法并稍加改动。用限制性内切酶EcoRΙ／MseΙ双酶切，加入接头连接后先用E－A／M－C预扩引物进行预扩增，将预扩产物稀释后，用筛选出的9对选扩引物（表1）进行PCR反应。体系为预扩模板1μL，10×Buffer 2μL，MgCl2（25mmol／L）1.2μL，dNTP（2.5mmol／L）1.6μL，EcoRΙ选扩引物（10mmol／L）0.4μL，MseΙ选扩引物（10mmol／L）0.8μL，Taq酶（5U／μL）0.5U，补足灭菌双蒸水至20 μL。选扩PCR反应程序为94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃1min（共12个循环，每一循环退火温度降低0.7℃，至56℃）；94℃30s，56℃30s，72℃1min（共25个循环）；最后72℃延伸10min。选扩产物经8%（质量分数）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染技术显带，GS－800扫描仪记录凝胶图谱。

实验所用的接头、预扩引物、选扩引物均由上海生工生物工程有限公司提供。

1.3 数据分析

选取AFLP指纹图谱中清晰且一致性较强的条带用于统计分析。以1和0分别表示条带的有无，将AFLP指纹图谱转化为0和1数字矩阵。用POPGENE 1.32软件计算多态位点数及其比例、Nei′s基因多样性指数、Shannon多样性指数、遗传距离和遗传相似度等。用AMOVA 1.55软件对群体间和群体内的遗传变异进行分子方差分析。聚类分析采用NTSYS 2.1软件构建UPGMA系统树。

2 结果

2.1 AFLP扩增结果

9对引物组合在2个大黄鱼养殖群体的40尾样品中共扩增出381条有效片段（主要分布于100～500 bp），其中多态片段为288条，多态位点比例为75.59%（表1）。每对引物扩增位点在36～51个，平均每对引物扩增出42.3个位点。其中，E－ACG／M－CAT扩增片段总数最多（51条），多态位点比例也最高（90.20%）；E－AAC／M－CAA扩增片段总数最少（36条），多态位点比例也最低（63.89%）。图1为E－ACG／M－CAT引物组合扩增的AFLP指纹图。

表1 2个大黄鱼养殖群体扩增位点数及多态位点比例Table 1 The number and percentage of polymorphic loci in two cultured populations of P.crocea

图1 E－ACG／M－CAT引物组合扩增得到的AFLP指纹图Fig.1 AFLP band patterns generated by primer combination E－ACG／M－CAT

2.2 2个大黄鱼养殖群体的遗传多样性

9对引物组合在岱衢洋大黄鱼养殖群体和官井洋大黄鱼养殖群体中分别扩增出363个和320个位点，多态位点数及多态位点比例分别为236（65.01%）和184（57.50%）。遗传多样性参数（表2）表明岱衢洋大黄鱼养殖群体的遗传多样性高于官井洋养殖群体的遗传多样性。

表2 2个大黄鱼养殖群体的遗传多样性参数Table 2 Parameters of genetic diversity in two cultured populations of P.crocea

2.3 2个大黄鱼养殖群体间的遗传分化

按遗传多样性参数（表2）估算来自2个群体间的变异为24.4%，75.6%的遗传变异来源于群体内不同个体间。

分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）结果表明群体间变异占37.74%，62.26%的变异源于群体内。显示出2个群体的遗传变异主要来自群体内个体间，但群体间已有一定程度的遗传分化（表3）。

表3 2个大黄鱼养殖群体内和群体间的AMOVA分析Table 3 AMOVA within and among two cultured populations of P.crocea

利用NTSYS 2.1软件以UPGMA法对大黄鱼2个群体40个个体进行聚类（图2）。图2中D1～D20为岱衢洋养殖群体，M1～M20为官井洋养殖群体，2个群体各自聚成一支（M1除外）。

图2 40尾大黄鱼个体构建的UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram of 40individuals of P.Crocea

3 讨论

我们利用AFLP技术对岱衢洋大黄鱼人工繁育F2代与官井洋大黄鱼人工繁育多代的养殖群体遗传多样性进行了分析和比较。9对选扩引物在40个大黄鱼样品中共扩增出288个多态位点，多态位点比例为75.59%，表明AFLP技术可扩增大量多态性位点，获得丰富的遗传信息。经检测，岱衢洋大黄鱼人工繁育F2代养殖群体的多态位点比例、Nei’s基因多样性指数、Shannon信息指数均高于官井洋大黄鱼人工繁育多代的养殖群体，表明前者的遗传多样性高于后者。同已报道的其他经济鱼类相比，多态位点百分率高于张全启等研究的牙鲆（Paralichthysolivaceus）野生群体与养殖群体（40.07%～46.18%）［17］、韩志强等研究的黄姑鱼（Nibeaalbiflora）野生群体（51.70%～51.99%）［18］、郑德锋等研究的棘头梅童鱼（Collichthyslucidus Richardson）野生群体（8.82%～15.07%）［19］及巫旗生等研究的褐毛鲿（Megalonibeafusca）养殖群体（24.60%～25.56%）［20］，低于彭志兰等研究的舟山鮸鱼（Miichthysmiiuy）群体（68.86%～72.51%）［21］。

岱衢洋大黄鱼人工繁育F2代养殖群体和官井洋大黄鱼人工繁育多代养殖群体间的遗传分化系数Gst（0.244 0）和分子方差分析（AMOVA）结果显示，2个群体的遗传变异主要来自于群体内个体间，但群体间亦出现了一定程度的遗传趋异。同时根据UPGMA法对40个个体的聚类结果可知，2个群体明显分成2支，表现出较显著的遗传分化，这和Gst，AMOVA所得结果相符。2个群体间存在一定程度的遗传分化，一方面可能是由于它们的起源亲本的来源不同，分别来源于岱衢洋及官井洋大黄鱼；另一方面，我们研究的岱衢洋大黄鱼F2代养殖群体是经过科学选育的群体，仍保持较高的遗传变异，而官井洋大黄鱼养殖群体是未经选育的多代繁殖的后代，传代过程中伴随着近交衰退及遗传漂变等作用，导致其遗传多样性降低。

Thorp［22］认为不同物种间的遗传相似系数I为0.2～0.8（Ds＝0.2～0.8），同科属群体间I为0.1～0.5（Ds＝0.5～0.9），同种群体间I为0.8～0.97（Ds＝0.03～0.2）。本研究的2个养殖群体间的遗传相似度为0.895 3，遗传距离为0.110 6，表明岱衢洋大黄鱼养殖群体和官井洋大黄鱼养殖群体仍属于同种群体间的范围内，没有造成大的分化。岱衢洋大黄鱼养殖群体和官井洋大黄鱼养殖群体间Nm值为1.549 5，表明大黄鱼2群体间存在一定程度的遗传信息交流。

（References）：

［1］WANG J，QUAN C G，SU Y Q，et al.Isoenzymes of wild and rearedPseudosciaenacrocea［J］.Marine Sciences，2001，25（6）：39－41.王军，全成干，苏永全，等.官井洋野生与养殖大黄鱼同工酶的研究［J］.海洋科学，2001，25（6）：39－41.

［2］LI M Y，ZHANG H Q，XUE L Y，et al.Analysis of genetic diversity ofPseudosciaenacroceaby isozyme and RAPD［J］.Journal of Fishery Sciences of China，2003，10（6）：523－525.李明云，张海琪，薛良义，等.网箱养殖大黄鱼遗传多样性的同工酶和RAPD分析［J］.中国水产科学，2003，10（6）：523－525.

［3］CHANG Y M，WANG W W，XU W T，et al.Genetic differentiation between F2and F3cultured populations in large yellow croakerPseudosciaenacrocea［J］.Oceanologia＆Limnologia Sinica，2009，40（4）：414－422.常玉梅，王文文，徐万土，等.人工繁育大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）群体F2及F3遗传差异分析［J］.海洋与湖沼，2009，40（4）：414－422.

［4］HUANG L M，XIE Y J，SU Y Q.Studies on genetic diversities of dai－ju stock and min－yue stockPseudosciaenacrocea（Richardson）［J］.Journal of Xiamen University：Natural Science，2006，45（6）：836－840.黄良敏，谢仰杰，苏永全.闽－粤东族与岱衢族养殖大黄鱼的遗传多样性研究［J］.厦门大学学报：自然科学版，2006，45（6）：836－840.

［5］DING S H，HUANG L Y，ZHANG H Q，et al.Analysis of genetic diversity in breeding and cultivated populations ofPseudosciaenacrocea［J］.Oceanologia＆Limnologia Sinica，2006，37（1）：41－46.丁诗华，黄丽英，张海琪，等.大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）岱衢洋选育群体和官井洋养殖群体的遗传差异分析［J］.海洋与湖沼，2006，37（1）：41－46.

［6］WANG W W，CHANG Y M，LIANG L Q.Genetic diversity of four large yellow croaker（PseudosciaenacroceaRichardson）populations using microsatellite markers［J］.Chinese Journal Fisheries，2009，22（2）：6－11.王文文，常玉梅，梁利群.微卫星分析四个大黄鱼群体的遗传多样性［J］.水产学杂志，2009，22（2）：6－11.

［7］HUANG Z Y，SU Y Q，ZHANG J S，et al.Study of cultured dai－qu and min－yue populations large yellow croakerPseudosciaenacroceaand its hybrid filial generations using SSR technology［J］.Oceanologia＆Limnologia Sinica，2011，42（4）：592－596.黄振远，苏永全，张建设，等.闽粤群和岱衢群养殖大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）及其杂交子代遗传差异的SSR分析［J］.海洋与湖沼，2011，42（4）：592－596.

［8］CHEN S Y，XU S X，ZHANG Z Y，et al.Study of genetic diversity of wild and culture populations ofPseudosciaenacroceausing two molecular markers［J］.Marine Sciences，2011，35（12）：82－87.陈淑吟，徐士霞，张志勇，等.大黄鱼野生群体与养殖群体遗传多样性研究［J］.海洋科学，2011，35（12）：82－87.

［9］MAO Y，JIANG Q F，ZENG H S，et al.Genetic diversity ofPseudosciaenacrocea（Richardson）based on mitochondrial DNA control region sequences［J］.Journal of Xiamen University：Natural Science，2010，49（3）：440－444.毛勇，蒋秋芬，曾华嵩，等.大黄鱼线粒体DNA控制区遗传多样性分析［J］.厦门大学学报：自然科学版，2010，49（3）：440－444.

［10］HUANG Z Y，WU C W，SU Y Q，et al.Assessment of genetic differentiation in the large yellow croaker，PseudosciaenacroceaRichardson，and its first hybrid filial generations with AFLP markers［J］.Gene，2012，510（2）：189－192.

［11］WANG Z Y，WANG Y L，LIN L M，et al.Genetic polymorphisms in wild and cultured large yellow croakerPseudosciaenacroceausing AFLP fingerprinting［J］.Journal of Fishery Sciences of China，2002，9（3）：198－202.王志勇，王艺磊，林利民，等.福建官井洋大黄鱼AFLP指纹多态性的研究［J］.中国水产科学，2002，9（3）：198－202.

［12］WANG X Q，WANG Z Y，LIU X C，et al.AFLP analysis of artificial gynogenesis inPseudosciaenacrocea［J］.Oceanologia＆Limnologia Sinica，2007，38（1）：22－28.王晓清，王志勇，柳小春，等.人工雌核发育大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）的 AFLP分析［J］.海洋与湖沼，2007，38（1）：22－28.

［13］LI Z B，FANG X，CHEN J，et al.Loss of the genetic diversity in cultivated populations ofPseudosciaenacroceaby AFLP［J］.Oceanologia＆Limnologia Sinica，2009，40（4）：446－450.黎中宝，方秀，陈锦，等.大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）养殖群体遗传多样性的降低［J］.海洋与湖沼，2009，40（4）：446－450.

［14］LIU B Q，DONG W Q，WANG Y J，et al.Identification of germ plasm inPseudosciaenacroceatai－chu race by AFLP［J］.Acta Hydrobiologica Sinica，2005，29（4）：413－416.刘必谦，董闻琦，王亚军，等.岱衢族大黄鱼种质的 AFLP分析［J］.水生生物学报，2005，29（4）：413－416.

［15］SAMBROOK J，FRITSCH E F，MANIATIST.Molecular cloning：a laboratory manual［M］.2nd ed.JIN D M，LI M F.Beijing：Science Press，1995.萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南［M］.第2版.金冬雁，黎孟枫，译.北京：科学出版社，1995.

［16］VOS P，HOGER R，BLEEKER M，et al.AFLP：a new technique for DNA fingerprinting［J］.Nucleic Acids Research，1995，23（21）：4407－4414.

［17］ZHANG Q Q，XU X F，QI J，et al.The genetic diversity of wild and farmed Japanese flounder populations［J］.Periodical of Ocean University of China，2004，34（5）：816－820.张全启，徐晓斐，齐洁，等.牙鲆野生群体与养殖群体的遗传多样性分析［J］.中国海洋大学学报：自然科学报，2004，34（5）：816－820.

［18］HAN Z Q，GAO T X，WANG Z Y，et al.Analysis of genetic diversity ofNibeaalbifloraby AFLP markers［J］.Journal of Fisheries of China，2006，30（5）：640－646.韩志强，高天翔，王志勇，等.黄姑鱼群体遗传多样性的AFLP分析［J］.水产学报，2006，30（5）：640－646.

［19］ZHENG D F，ZHAO J L，ZHOU W Y，et al.Genetic structure ofCollichthysluciduspopulations from China coastal areas by AFLP analysis［J］.Oceanologia＆Limnologia Sinica，2011，42（3）：443－447.郑德锋，赵金良，周文玉，等.我国沿海棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）群体遗传结构的 AFLP分析［J］.海洋与湖沼，2011，42（3）：443－447.

［20］WU Q S，ZENG Z N，SONG C F，et al.AFLP analysis on genetic diversity ofMegalonibeafuscacultured populations in Dongshan and Yangjiang［J］.Journal of Fujian Fisheries，2012，34（6）：435－439.巫旗生，曾志南，宋传福，等.福建东山和广东阳江褐毛鲿养殖群体遗传多样性的 AFLP分析［J］.福建水产，2012，34（6）：435－439.

［21］PENG Z L，LIU M H，FU R B，et al.Comparative studies on the molecular genetic diversities between the Zhoushan wildMiichthys miiuyand their early filial generation by AFLP markers［J］.Journal of Shanghai Ocean University，2010，19（2）：172－177.彭志兰，刘敏海，傅荣兵，等.舟山鮸鱼群体遗传多样性的AFLP研究［J］.上海海洋大学学报，2010，19（2）：172－177.

［22］THORP J P.The molecular dock hypothesis：Biochemical evolution，genetic differentiation，and systematics［J］.Annual Review of Ecology Systematics，1982，13（1）：139－168.