HPLC法评价高良姜素分子印迹固体萃取柱的分离效率

杨 岚，支 岭，宋成军，苗光新，吴晓光，刘翠哲

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

HPLC法评价高良姜素分子印迹固体萃取柱的分离效率

杨 岚，支 岭，宋成军，苗光新，吴晓光，刘翠哲△

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

目的：采用HPLC法测定高良姜素的含量，从而评价高良姜素分子印迹萃取柱的分离效率。方法：以高良姜素为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，丙酮为致孔剂，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，制备高良姜素分子印迹聚合物，采用HPLC法测定分离出的高良姜素的含量，以评价分子印迹萃取柱的分离效率。结果：高良姜素在1.0-5.0☒g/ml范围内呈良好的线性关系，线性方程为y=17014x+457.2，r=0.9989（n=5）。高良姜素的平均含量为0.91%，RSD为2.4%（n=6）。结论：高良姜素分子印迹萃取柱的分离效率较高，可以很好的分离高良姜饮片提取液中的高良姜素。

HPLC；高良姜素；分子印迹萃取柱；分离效率

高良姜是姜科山姜属植物高良姜Alpinia officinarum Hance的干燥根茎，味辛、性温，具有温胃祛寒、理气祛风、消食止痛的功效，是中医临床上常用的温里药［1-2］。高良姜素（Galangin，3，5，7-三羟基黄酮）是高良姜最主要的药理活性成份，对高良姜的鉴别具有独特的专属性。临床药理学研究表明，高良姜素具有抗氧化、抗细菌、抗炎、抗突变、抗肿瘤等多种生物活性，具有良好的临床应用价值和研究前景［3-4］。分子印迹聚合物（molecular imprinting polymers，MIPs）是指一种在空间结构上和结合位点上具有与某一分子（模板分子）完全匹配的交联聚合物［5］。MIPs具有在空间结构和功能基的位置上与模板分子高度吻合的特点，因而具备从复杂样品中对模板分子及其结构类似物进行记忆性选择识别的能力［6］。本研究采用分子印迹技术分离高良姜提取物中高良姜素，并用高效液相色谱（HPLC）法测定其含量，以此评价高良姜素分子印迹固相萃取柱的分离效率。

1 材料

1.1 试剂 高良姜饮片：同仁堂大药房；高良姜素：中国药品生物制品检定所，批号：110501，纯度：99%；丙烯酰胺、偶氮二异丁腈、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙醇、丙酮、甲醇等试剂均为分析纯。

1.2 仪器 HH-S型恒温水浴锅：江苏金坛医疗仪器厂；KQ-250DE型超声波清洗器（40kHz）：昆山市超声仪器有限公司；BS-210S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；LC-AT20型高效液相色谱仪：岛津公司；N3000色谱工作站：浙江大学；TC-C18色谱柱：安捷伦公司。

2 方法与结果

2.1 高良姜素对照品溶液的配制 精密称取高良姜素对照品1.0mg，加甲醇定容至10ml容量瓶中，制成0.10mg/ml的对照品溶液。

2.2 高良姜提取物样品溶液的制备 取10g粉碎的高良姜饮片粉末置于锥形瓶中，加入浓度75%的乙醇溶液200ml，在温度为55℃、提取功率100W的条件下，超声提取30min，共提取3次，过滤，合并滤液，减压浓缩，甲醇溶解定容至10ml备用。

2.3 高良姜素供试品溶液的制备 称取0.27g高良姜素和0.28g功能单体丙烯酰胺充分溶解于4ml丙酮中，于安瓿瓶中超声2h，再加入3.8ml乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.022g偶氮二异丁腈，充分混溶后，通氮气10min，真空密封。将密封好的安瓿瓶于60℃下聚合24h，所得的聚合物磨碎、过筛，用体积比为9：1的甲醇和乙酸混合溶液于索氏提取器中提取24h，然后用甲醇洗至中性，将聚合物颗粒经丙酮反复沉降，真空干燥至恒重，即为高良姜素分子印迹聚合物。

称取高良姜素分子印迹聚合物0.5g，加入5ml甲醇制成混悬液，采用湿法装柱法装入5ml/1cm的注射器中，用甲醇淋洗装好的柱子。取2.2制备的高良姜饮片提取物10ml上分子印迹聚合物固相萃取柱，收集洗脱液作为供试品溶液。

2.4 HPLC法色谱条件 使用TC-C18色谱柱（4.6mm× 250mm，5☒m）。流动相为甲醇：0.2%醋酸=70：30，柱温为25℃，流速为1ml/min。将上述对照品溶液和供试品溶液稀释适当倍数，过45 μ m微孔滤膜后，各精密吸取20☒l进样，在355nm处扫描色谱图（图1）。

图1 高良姜素标准品（1）和样品（2）色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察：将高良姜素对照品溶液精确稀释100倍后，分别吸取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml及5.0ml稀释至5ml，各取20☒l进样，在上述色谱条件下测定峰面积，重复测定3次。以峰面积平均值为纵坐标，以对应的对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线（图2）。线性方程为y=17014x+457.2，r=0.9989（n=5），高良姜素在1.0-5.0☒g/ml范围内呈良好的线性关系。

图2 高良姜素HPL法标准曲线

2.5.3 重复性试验：取同一批号药材10g，按2.3的方法平行制备6份供试品溶液，记录高良姜素峰面积，计算RSD=1.74%（n=6），表明提取方法的重现性良好。

2.5.4 稳定性试验：取同一份供试品溶液，在相同的色谱条件下分别在0、1、3、6、9、12、18、24h进样分析，记录高良姜素峰面积，计算RSD=1.96%（n=6），表明供试品溶液在24h内稳定。2.5.5 回收率试验：取同一批样品6份，称取粉末10g，分别精密加入加样回收率用对照品溶液，10☒l进样，依法测定，计算平均回收率为101.71%、RSD值为2.32%。见附表：

附表 高良姜素回收率试验结果

2.6 高良姜素含量测定 称取高良姜粉末10.0g，平行测定6组。按2.3的方法制备高良姜提取物供试品溶液，然后按2.4的色谱条件测定样品高良姜素的含量。测得高良姜素的平均含量为0.91%，RSD为2.4%。

3 讨论

前期对提取溶剂、提取方式、提取时间和溶剂用量进行了考察，回流提取法所含杂质较多且操作较繁琐，故采用简便快捷高效率的超声提取法。

本研究优化了采用HPLC法测定高良姜中高良姜素含量的方法，该方法方便快捷，溶剂用量省，环境污染少，实验测得高良姜素含量较高，高良姜素分子印迹固相萃取柱可以高效的分离高良姜单体。

本研究使用的分子印迹技术具有良好的选择性和识别性，将其用于复杂中药的提取分离过程中，能简化实验步骤、提高分离效率，对于从复杂的中草药体系中选择性地分离和提取有效功能因子的研究具有十分重要的应用价值和现实意义。

［1］黄慧珍，杨丹.高良姜的化学成分及其药理活性研究进展［J］.广东化工，2009，36（1）：77-80.

［2］张道广，王柯，季申.高良姜中高良姜素含量的高效液相色谱法测定［J］.时珍国医国药，2010，21（12）：3177-3178.

［3］邓亦峰，冯丽娜，罗辉.反相高效液相色潽法测定不同月份高良姜中高良姜素的含量［J］.中国药学杂志，2010，45（20）：1593-1595.

［4］马丽萍，丘小惠，闵江.高良姜饮片HPLC指纹图谱及高良姜素含量测定研究［J］.中成药，2008，30（11）：1565-1569.

［5］尹艳凤，李倦生，姚运先，等.大黄素分子印迹整体柱的合成及性能表征［J］.分析测试学报，2008，27（7）：758-761.

［6］邓茜珊，苏立强.橙皮素分子印迹聚合物的制备及其性能研究［J］.化工时代，2009，23（4）：28-30.

EVALUATION THE SEPARATION EFFICIENCY OF GALANGIN MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS BY HPLC

YANG Lan， ZHI Ling， SONG Cheng-jun， et al

(Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To evaluate the separation efficiency of Galangin molecular imprinted polymers by detecting the Galangin contents with HPLC.Methods:The Galangin molecular imprinted polymers were prepared by using Galangin as template molecule， acrylamide as functional monomers， acetone as pore-foaming agent， ethylene glycol dimethyl acrylic ester as crosslinking agent. The separation efficiency of Galangin molecular imprinted polymers was evaluated by detecting the Galangin content by HPLC.Results:The linear range of Galangin was 1.0-5.0 μg/ml， the linear equation was y=17014x+457.2 （r=0.9989，n=5）.The average content of Galangin was 0.91% （RSD=2.4%， n=6）. Conclusions: The separation efficiency of Galangin molecular imprinted polymers is higher； and it can separate the Galangin in Alpinia officinarum well.

HPLC； Galangin； Molecular imprinting polymers； Separation effi ciency

R284.2

A

1004-6879（2015）03-0190-03

2014-11-04）