食道鳞状细胞癌组织及癌旁组织中sonic hedgehog和patched1的表达

张 满 崔宏伟 师迎旭 杨 凌

1.内蒙古医科大学附属医院胸外科，内蒙古呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心，内蒙古呼和浩特 010050；3.内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古呼和浩特 010050

食道鳞状细胞癌组织及癌旁组织中sonic hedgehog和patched1的表达

张 满1崔宏伟2师迎旭3杨 凌2

1.内蒙古医科大学附属医院胸外科，内蒙古呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心，内蒙古呼和浩特 010050；3.内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古呼和浩特 010050

目的在食道鳞状细胞癌和配对癌旁组织中检测sonic hedgehog（SHH）和patched1（PTCH1）的表达。 方法选取内蒙古医科大学附属医院胸外科2012～2014年经手术切除、病理科确诊为食道鳞状细胞癌的标本共30例及其癌旁组织，应用免疫组织化学染色方法检测SHH和patched1的表达。结果在30例食道鳞状细胞癌组织中10例（33.3%）PTCH1阳性表达，肿瘤组织中未检测到SHH蛋白的表达，癌旁组织中未见两种蛋白的表达。PTCH1的表达与患者吸烟、饮酒，食道鳞状细胞癌的肿瘤分化、分期，淋巴结转移无关（P＞0.05）。 结论 SHH的表达不是激活hedgehog通路的原因。

食道鳞状细胞癌；癌旁组织；Sonic hedgehog；Patched1

食道癌是全球范围内癌症导致死亡中排名第六的疾病。我国食道鳞状细胞癌的发病率占全世界总和的70%[1]。食道鳞状细胞癌在我国因肿瘤死亡的疾病中排名第四[2]。食道癌在组织学上有两种主要的类型：鳞状细胞癌和腺癌这两种亚型在不同的地区有不同的发病率：在世界范围内食道鳞状细胞癌是主要的食道癌类型，而在美国腺癌的发病率几乎和美洲白人的鳞状细胞癌发病率一样高[3]。由于大多数的食道癌在晚期被发现，导致其高死亡率。发现和鉴定灵敏的、特异性高的食道癌分子标志物将有助于早期诊断和发展对晚期食道癌患者的高效的靶向性治疗。

作为一个重要的发育相关信号通路，hedgehog信号通路对维持组织极性和干细胞群体起到重要作用。hedgehog通路组分也在多种上皮肿瘤中持续有活性，包括肺癌，胰腺癌，其他胃肠道肿瘤和前列腺癌[4-10]。为了更好地阐明hedgehog信号激活在食道癌发生和发展过程的作用，本研究检测了hedgehog靶基因patched1（PTCH1）和配体蛋白sonic hedgehog（SHH）在食道鳞状细胞癌中及配对的癌旁组织中的表达，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取内蒙古医科大学附属医院胸外科2012～2014年经手术切除、病理确诊为食道鳞状细胞癌患者30例的标本及其癌旁组织，其中男25例，女5例，年龄42～79岁，平均年龄为（61.4±9.2）岁。所有患者术前均未行放化疗治疗，病理类型为鳞状细胞癌，其中高～中分化20例，低分化10例，分期Ⅱ级21例，Ⅲ级9例。另选择距肿瘤边缘2 cm处经病理证实为正常组织的食道黏膜作为对照。所有患者均知情同意，且研究经本院伦理委员会批准。

1.2 免疫组织化学

标本均经4%多聚甲醛固定、石蜡包埋，切厚度为5 μm片，烤片备用。根据免疫组织化学试剂盒Universal Quick Kit（美国VECTOR公司）步骤，应用S-P免疫组化二步法，使用底物试剂盒VECTOR NOVARED Substrate Kit显色，脱水，透明和封片后在显微镜下进行观察。SHH抗体、PTCH1抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司。

1.3 结果判断标准

细胞以出现红色颗粒为阳性。对阳性细胞计数是随机取5个高倍视野进行计数，并取细胞计数平均值。免疫组织化学得分（0、0.5、1、1.5、2、3分）是由染色强度（0分：没有染色；1分：轻微染色；2分：中度染色；3分：重度染色）乘以染色密度（0分：阳性细胞比例＜10%；0.5分：阳性细胞比例10%～30%；1分：阳性细胞比例＞30%）。染色的结果分为阴性（免疫组织化学得分=0）和阳性（免疫组织化学得分＞0）。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用Fisher确切概率χ2检验，配对计数资料的比较采用Fisher确切概率法McNemar检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PTCH1在10例 （33.3%）的肿瘤组织有阳性表达，而在正常的食道组织中无PTCH1的表达 （P＜0.01）（图1，见封四）。在肿瘤组织中组织无SHH的表达。进一步分析显示PTCH1的表达与吸烟，饮酒不相关（P＞0.05）（表1），说明吸烟或是饮酒可能不是直接引起hedgehog通路激活的原因。PTCH1表达与食道鳞状细胞癌的肿瘤分化、分期或是淋巴结转移无关（P＞0.05）（表1）。

表1 食道鳞状细胞癌临床资料与PTCH1蛋白表达的相关性（例）

3 讨论

hedgehog信号通路的主要传导机制从果蝇到人类是相对保守的。七次跨膜蛋白smoothened（SMO）是该途径的信号转导的关键分子，另一个跨膜蛋白Patched（PTCH）在没有hedgehog配体的情况下会抑制 SMO的功能。在有 hedgehog配体的情况下，hedgehog和它的受体PTCH结合，释放PTCH对SMO的抑制，SMO传导信号最终到Gli转录因子。作为转录因子，Gli通过与靶基因的起始区特异序列直接结合来调控其表达。有报道在几种食道癌细胞系和食道癌标本中发现SHH和信号通路靶基因的表达增加[10-12]。Gli的表达与肿瘤浸润的深度，淋巴结转移和预后差相关[11]。研究还表明进行放化疗的患者Gli在细胞核表达要比Gli在细胞质表达的患者的预后差[13]。

在我国食道鳞状细胞癌是食道癌主要的亚型。在食道鳞状细胞癌中发现高频率的myc基因扩增和偶尔的kras基因的突变。且在食道鳞状细胞癌中cyclinD1的表达上升是很普遍的[14-15]。本研究收集了30例食道鳞状细胞癌和癌旁组织。结果显示，鳞状细胞癌组织中PTCH1的表达显著高于癌旁组织（P＜0.01），提示食道鳞状细胞癌表现出分子水平上的异质性。但是30例食道鳞状细胞癌组织中，只在10例（33.3%）肿瘤组织中发现PTCH1的阳性表达，低于Zhang等[16]报道的104例食道鳞状细胞癌中60%GLi1的阳性表达，分析其原因可能是①实验中的食道鳞状细胞癌的取材的地区不同；②检测的通路分子不同，本研究中检测的通路靶基因为PTCH1，Zhang等[16]的研究中鉴定的通路靶基因为GLi1；③本实验中的标本例数较少。事实上，食道鳞状细胞癌中已报道的各种分子变化的频率都不高。所以在分子水平上对食道鳞状细胞癌进行分类需要更多的研究，包括在更大的范围内研究每一例肿瘤的多个分子的变化。

已有的研究表明hedgehog信号通路的活性与SHH的表达的升高相关[12]。在本次研究中，没有发现SHH的表达。这些结果说明本次实验的标本例数较少或是hedgehog通路中其他的变化导致了信号通路的激活。其可能的机制有Indian hedgehog的表达升高，信号通路负调节子的过甲基化[如HIP，Su（Fu）]，信号通路下游分子基因的扩增（如Gli转录因子）。有研究表明胃癌、食道癌和直肠癌中HIP启动子的过甲基化导致HIP的表达下降[17]。在肺癌细胞中研究发现由于过甲基化而导致Su（Fu）基因的沉默[18]。尽管每个组织中hedgehog信号通路激活的原因需要进一步的研究，然而SHH的表达提高并不是激活hedgehog通路的唯一机制。基于这些发现，可以预测对于hedgehog通路激活的食道癌的治疗策略要具体情况具体对待。例如，对于过表达SHH而引发hedgehog通路激活的肿瘤可以用SHH中和抗体或是SMO拮抗剂来治疗；对于Gli1或是Su（Fu）分子变化而引发的肿瘤可以用Gli1的抑制剂来治疗；而对于hedgehog通路没有激活的肿瘤用hedgehog通路抑制剂来治疗可能没有任何作用。

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Expression of sonic hedgehog and patched1 in esophageal squamous cell carcinomas and adjacent tissues

ZHANG Man1CUI Hongwei2SHI Yingxu3YANG Ling2

1.Department of Thoracic Surgery,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot 010050,China;2.Clinical Medical Research Center,Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot 010050,China;3.Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,Inner Mongolia Autonomous Region,Huhhot010050,China

Objective To examine expression of sonic hedgehog(SHH)and patched1(PTCH1)in esophageal squamous cell carcinomas and paired adjacent tissues.Methods From 2012 to 2014,in Department of Thoracic Surgery,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University,30 samples from esophageal squamous cell carcinomas and paired adjacent tissues diagnosed by pathologist were selected,expression of SHH and PTCH1 were detected by immunohistochemistry method.Results Among 30 esophageal squamous cell carcinomas tissues,10 cases (33.3%)had patched1 positive expression,no expression of SHH was detected in tumor tissues,no expression of PTCH1 and SHH was detected in adjacent tissues.Statistical analysis revealed that PTCH1 expression was not associated with smoking, drinking,differentiation,stage and lymph node metastasis of cancer(P＞0.05).Conclusion Expression of sonic hedgehog is not the reason for activation of the hedgehog pathway.

Esophageal squamous cell carcinoma;Adjacent normal tissues;Sonic hedgehog;Patched1

R735.1

A

1673-7210(2015)11(b)-0091-03

2015-07-02本文编辑：苏 畅）

内蒙古自治区自然科学基金项目（2013MS1129）；内蒙古医科大学附属医院一般科研项目（NYFYYB2014012）。

张满（1984-），男，硕士；研究方向：胸部肿瘤临床及基础研究。

杨凌 （1981-），女，博士；研究方向：肿瘤中hedgehog通路研究。