DNA-蛋白激酶依赖蛋白激酶催化亚基在鼻咽癌中的表达及意义

黃 俐 徐细明 蒿艳蓉 杨 姣 陈甲信 李 雷 陈俊萍 陈朝红

1.武汉大学人民医院肿瘤中心，湖北武汉 430000；2.广西壮族自治区人民医院肿瘤中心，广西南宁 530000

DNA-蛋白激酶依赖蛋白激酶催化亚基在鼻咽癌中的表达及意义

黃 俐1，2徐细明1蒿艳蓉2杨 姣2陈甲信2李 雷2陈俊萍2陈朝红2

1.武汉大学人民医院肿瘤中心，湖北武汉 430000；2.广西壮族自治区人民医院肿瘤中心，广西南宁 530000

目的 探讨DNA-蛋白激酶依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）在鼻咽癌中的表达及其临床意义。 方法选取2007年5月～2012年7月于广西壮族自治区人民医院肿瘤中心的83例鼻咽癌患者（鼻咽癌组）和32例鼻咽炎患者（鼻咽炎组），通过免疫组织化学的研究方法分析DNA-PKcs的表达情况，并通过分层分析的方法评估DNA-PKcs与鼻咽癌临床病理学因素之间的联系，进一步分析DNA-PKcs的表达与鼻咽癌预后之间的相关性。结果鼻咽癌患者DNA-PKcs的表达明显高于鼻咽炎患者，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；DNA-PKcs的表达水平与鼻咽癌的病理分型、临床分期、体力量表评分、年龄、性别无关（P＞0.05）；DNA-PKcs的表达水平与鼻咽癌患者的近期疗效无显著相关性 （P＞0.05）；DNA-PKcs的表达水平越高，鼻咽癌患者的远期生存时间越长 （P＜0.01）。 结论DNA-PKcs在鼻咽癌中高表达可以作为一个鼻咽癌预后的预测指标。

DNA-蛋白激酶依赖蛋白激酶催化亚基；鼻咽癌；鼻咽炎；免疫组化

鼻咽癌是我国南方普发的一种上皮性肿瘤[1-2]。我国的鼻咽癌人群几乎占亚洲国家鼻咽癌患者的50%。由于鼻咽癌组织对辐射具有高度敏感性，因此临床上通常将放射治疗作为鼻咽癌患者的首选治疗方案[3-5]。随着近代医学技术的发展，鼻咽癌的5年生存率已经超过了50%[6]，但是仍然有大量鼻咽癌患者发生放疗后肿瘤进展的情况[7-9]。因此，找到提高鼻咽癌患者放疗敏感性的靶点，成为了突破鼻咽癌治疗的关键点[10-11]。本研究在课题组前期研究结果上进一步扩大样本量，通过分析DNA-蛋白激酶依赖蛋白激酶催化亚基（catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase，DNA-PKcs）在鼻咽癌和鼻咽炎组织中表达的差异，进一步探讨DNA-PKcs与鼻咽癌预后的相关性，从而期望为鼻咽癌找到一些潜在的放疗增敏的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2007年5月～2012年7月广西壮族自治区人民医院（以下简称“我院”）肿瘤中心经病理诊断的患者中符合条件的83例鼻咽癌患者（鼻咽癌组）和32例鼻咽炎患者（鼻咽炎组）为研究对象。所有患者均在我院耳鼻喉专科经鼻咽部活检取得新鲜组织标本，制成石蜡包埋组织块，连续做4 μm厚切片。每个患者的组织标本均切片5张备用。鼻咽癌患者入组条件：①年龄18～76岁；②体力量表评分（PS评分）≤2分；③所有病例均为初诊患者且未接受过任何抗肿瘤治疗；④经全身检查排除其他疾病且无肿瘤转移病史和其他肿瘤病史；⑤根据美国国立综合癌症网络（NCCN）的推荐，所有鼻咽癌患者按照美国癌症联合委员会（AJCC）sixth Edition 2002版分期，其中Ⅰ～Ⅱ期患者仅接受调强放疗，而Ⅲ～ⅣB期患者则行同步放化疗（CRT）治疗合并或不合并必要的辅助化疗；⑥治疗前所有鼻咽癌患者均经鼻咽+颅底+颈部MRI平扫+增强检查，检查结果作为基线水平。鼻咽炎患者入组条件：①年龄18～76岁；②经全身检查排除其他疾病。本研究经过了我院伦理委员会的许可，并征得了每个患者同意。

1.2 治疗方案

根据鼻咽癌NCCN 2007版指南推荐，Ⅰ期和Ⅱ期鼻咽癌患者接受单纯根治性调强放疗（IMRT）。IMRT方案：①鼻咽部：总剂量68～76 Gy，1次/d，2.12～2.30 Gy/次，共30～35次；②颈部阳性淋巴结：GTVn总剂量60～70Gy，1次/d，1.80～2.16 Gy/次，共30～35次；③颈部阴性淋巴结：CTVn总剂量50～55 Gy，1次/d，1.56～1.70 Gy/次，共30～35次。

表1 83例鼻咽癌患者的临床资料

Ⅲ期和Ⅳ期的鼻咽癌患者接受以铂类为主的同步放化疗。IMRT方案：同Ⅰ和Ⅱ期患者。化疗方案：顺铂40 mg/m2，1次/周，6～7周。放疗第1天同步开始给药。同步放化疗1个月后采用CT或MRI进行疗效评价。疗效评价不能达到完全缓解（CR）或部分缓解（PR）的患者，再行辅助化疗。

1.3 实验方法

①60℃烤箱中烤片2 h。②切片浸泡于二甲苯中脱蜡，15 min/次，一共3次。然后按从高浓度到低浓度的顺序，依次将切片浸泡于梯度酒精（酒精浓度依次为100%、95%、90%、80%、70%）中，每个浓度中均浸泡5 min。双蒸水洗片5 min/次，一共3次。PBS洗片5 min/次，一共3次。③切片浸泡于柠檬酸盐溶液（pH值6.0）中，置于高压锅内95°C煮沸2 min/次，连续3次，每2次间隔1 min。自然晾至室温。PBS洗片5 min/次，一共3次。④将切片浸泡于3%双氧水中10 min，PBS洗片5 min/次，一共3次。⑤26℃环境中用正常绵羊血清封闭组织15 min。⑥倾去血清，用稀释后的DNA-PKcs单克隆一抗（兔抗人单克隆抗体购自北京博奥森公司，稀释比例1∶200）4℃孵育过夜。⑦切片置于室温复温20 min后，用PBS洗片5 min/次，一共3次。然后用多克隆二抗26℃孵育15 min，PBS洗片5 min/次，一共3次。⑧用DAB显色试剂显色5～10 min，显微镜下观察显色结果，适时终止。用自来水轻柔冲洗片刻。⑨用苏木精复染1 min，自来水冲洗片刻，1%的盐酸酒精溶液分化3 s，自来水冲洗片刻后，用氨水返蓝1 min。⑩按从低浓度到高浓度的顺序，依次将切片浸泡于梯度酒精 （酒精浓度依次为70%、80%、90%、95%、100%）中脱水5 min，然后浸泡于二甲苯中15 min/次，一共3次。最后用中性树脂封片固定。电子显微镜观测计数。说明：免疫组化试剂盒购自中杉金桥公司；每一批次实验中均设置阳性对照片和阴性对照片；已知阳性反应标本作为阳性对照，与实验切片采用同种一抗、二抗；PBS代替一抗作为阴性对照进行同步染色。

1.4 结果评价标准

1.4.1 免疫组化结果评价 DNA-PKcs阳性物质表达主要定位于细胞核。由3名经验丰富的病理科医生在不知患者临床资料的情况下采用Volm双评分法经电子显微镜下进行结果评估。每张切片选取5个高倍镜视野观察。评价标准：按阳性细胞数比率评分：＜25%为1分，25%～50%为2分，＞50%为3分；按染色强度评分：不着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。二者分数相加即为判断结果：阴性（-）：0分；弱阳性（+）：1～2分；中度阳性（++）：3～4分；强阳性（+++）：5～6分。

1.4.2 鼻咽癌患者疗效评价判定 83例鼻咽癌患者按计划完成相应治疗1个月后，采用鼻咽+颅底+颈部MRI平扫+增强检查，与治疗前MRI结果对比后进行疗效评价，疗效评价参照国际上通用实体瘤的疗效评价标准（RECIST）1.1版指南[12]。

1.5 随访情况

所有病例从患者出院后开始进行定期常规随访，随访日期截至2014年10月。常规随访评价第1年与第2年，每3个月进行1次，然后在接下来的3年，每6个月进行1次，此后每年（或当临床症状提示有必要时）进行1次。中位随访时间27个月。至随访结束，26例患者发生肿瘤远处转移，12例肝转移，9例肺转移，5例骨转移。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，生存时间的关系用Kaplan-Meier生存曲线进行单因素分析，生存曲线的差异性分析用log-rank检验，鼻咽癌患者无转移生存多因素分析采用Cox模型进行，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果

根据Volm双评分法评价，鼻咽癌患者中DNA-PKcs强阳性表达者占18.07%（图1A，见封四），中度阳性表达者占33.73%，弱阳性表达者占13.25%，阴性表达者占34.93%（图1B，见封四）。而鼻咽炎患者中DNAPKcs强阳性占0.00%，中度表达者占6.25%，弱阳性表达者占15.63%，阴性表达者占78.13%。二者之间DNA-PKcs的表达情况存在显著差异 （P=0.007），鼻咽癌患者的DNA-PKcs表达明显高于鼻咽炎患者。见表2。

表2 83例鼻咽癌患者与32例鼻咽炎患者DNA-PKcs的表达情况（例）

2.2 DNA-PKcs的表达情况与临床资料之间的关联

经过多因素分析，鼻咽癌DNA-PKcs的表达情况与性别、年龄、病理分型、AJCC分期、PS评分因素均无明显关联（均P＞0.05）。见表3。

表3 鼻咽癌患者DNA-PKcs的表达情况与临床因素的相关性分析（例）

2.3 DNA-PKcs的表达情况与鼻咽癌患者近期疗效的相关性分析

根据RECIST 1.1版指南对鼻咽癌的近期疗效进行评估，所有鼻咽癌患者均达到了CR或PR，客观缓解率达100%。本研究进一步考察患者的DNA-PKcs表达情况与患者鼻咽癌CR是否有关联。结果显示DNA-PKcs的表达与鼻咽癌的近期疗效无显著相关性（P＞0.05）。见表4。

表4 DNA-PKcs的表达情况与鼻咽癌患者近期疗效的相关性分析（例）

2.4 鼻咽癌无转移生存的多因素分析

应用Cox模型对83例鼻咽癌患者无转移生存率进行多因素生存分析，结果显示DNA-PKcs的表达水平是影响鼻咽癌患者预后的独立因素（P＜0.05）。见表5。

表5 鼻癌咽患者无转移生存的多因素分析

2.5 DNA-PKcs的表达水平与患者生存时间分析

本研究应用Kaplan-Meier生存曲线对DNAPKcs的表达情况与鼻咽癌患者生存时间关系进行单因素分析发现DNA-PKcs的总体表达水平和患者的生存时间呈正相关（P＜0.01），见图2。DNA-PKcs的表达水平越高，患者的生存时间越长。根据总体生存曲线，笔者可以推测DNA-PKcs的阳性表达组和阴性表达组之间生存时间相差较大，而各个阳性表达组之间的生存时间没有明显区别。本研究按DNA-PKcs阳性和阴性表达分组，单独做出生存曲线，可以证实前面的推测，两组之间的区别很明显（P＜0.01）。见图3。

图2 不同DNA-PKcs表达水平下的生存曲线比较

图3 DNA-PKcs阳性表达组与阴性表达组之间的生存曲线比较

3 讨论

恶性肿瘤的发生往往伴随着遗传物质的异常改变[13-15]。各种外源性或内源性的因素对DNA的累积损伤会导致细胞正常增殖分化生长机制紊乱，从而形成持续性异常细胞微环境，导致肿瘤的发生[11]。但机体中也存在对抗DNA损伤的因子，DNA-PKcs就是主要从事DNA双链断裂修复的一种肿瘤抑癌基因[16-17]。DNA-PKcs是PI3K家族中的一员，是DNA依赖蛋白酶的催化亚单位[18]。当机体DNA受到一定损伤断裂，会自动启动NHEJ修复机制，DNA-PKcs作为修复家族的一员会参与DNA断裂的非同源末端连接的修复，同时，DNA-PKcs可以维持人体正常免疫功能，调节DNA修复，防止细胞进一步恶变[19]。

本研究结果显示，鼻咽癌中DNA-PKcs的表达水平高于鼻咽炎组织，这提示DNA-PKcs对于正常组织细胞DNA具有修复作用。炎症组织中DNA断裂损伤较少，修复基因DNA-PKcs的含量也较少。但进一步研究分析却发现鼻咽癌中DNA-PKcs的表达水平越高，鼻咽癌患者的预后反而越好。肿瘤组织中高水平表达的DNA-PKcs能一定程度上修复断裂损伤的DNA，因此，DNA-PKcs高表达的患者预后相应比低水平的患者好。但值得注意的是，DNA的修复只能是一定程度上的，如果断裂程度高、断裂的DNA数量多，肿瘤依然大体上呈进展趋势[20-21]，这与本研究中的分层分析结果一致。但是，有些学者却正好得出与本实验相反的结论，Yan等[21]的研究结果表明DNA-PKcs表达水平越低鼻咽癌放疗效果越好，这也许与入组人群有关，其研究入组的患者年龄相对本实验偏小。另外，这一结果和不同医院的放疗效果也相关。鉴于关于DNA-PKcs在鼻咽癌中的表达水平的报道目前还很少，这一争论还有待继续验证。关于DNA-PKcs在鼻咽癌中作用机制也有待于进一步探讨。但是，值得肯定的是DNA-PKcs未来被作为鼻咽癌的诊断靶点是很有可能的。

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The expression and clinical significance of DNA-PKcs in nasopharyngeal carcinoma through hierarchical analysis

HUANG Li1,2XU Ximing1HAO Yanrong2YANG Jiao2CHEN Jiaxin2LI Lei2CHEN Junping2CHEN Zhaohong2

1.Department of Cancer Center,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei Province,Wuhan 430000,China;2.Department of Cancer Center,People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530000,China

Objective To explore the expression and the clinical significance of DNA-PKcs in nasopharyngeal carcinoma.Methods Diagnostic tissues of 83 nasopharyngeal carcinoma patients(nasopharyngeal carcinoma group)and 32 nasopharyngitis patients(nasopharyngitis group)from Cancer Center of People's Hospital of Guangxi Autonomous Region from May 2007 to July 2012 were evaluated retrospectively.The expression of DNA-PKcs was analyzed by immunohistochemical and the relationship between the expression of DNA-PKcs and the clinical pathological factors in nasopharyngeal carcinoma were evaluated through the retrospective study methods.Results The expression of DNA-PKcs existed between nasopharyngeal carcinoma patients and nasopharyngitis patients,and the differences were statistically significant(P＜0.01).However,there was no relevance between the expression of DNA-PKcs and pathology classification, clinical stage,PS score,age or gender(P＞0.05).The expression level of DNA-PKcs had no relationship with the recent efficacy of patients with nasopharyngeal carcinoma,and the difference was not statistically significant(P＞0.05).The long-term survival of patients with nasopharyngeal carcinoma was longer,when the expression level of DNA-PKcs was higher,and the difference was statistically significant(P＜0.01).Conclusion High expression of DNA-PKcs can be used as a predictor of prognosis in nasopharyngeal carcinoma.

Catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase;Nasopharyngeal carcinoma;Nasopharyngitis;Immunohistochemical

R739.6

A

1673-7210(2015)11(b)-0004-05

2015-04-27本文编辑：关 婧）

国家自然科学基金资助项目（81260348）；广西卫生厅重点项目（桂卫重2010037）。

黄俐（1989.8-），女，武汉大学2012级肿瘤学在读硕士研究生（武汉大学人民医院与广西壮族自治区人民医院联合培养），主要从事恶性肿瘤临床及基础学的研究工作。

徐细明（1976.8-），男，博士，主任医师，教授，硕士研究生导师，擅长消化道肿瘤的综合治疗。蒿艳蓉（1967.11-），女，博士，副主任医师，硕士研究生导师，主要从事恶性肿瘤的临床及基础的研究工作。