三种方法测定糖化血红蛋白的一致性和可靠性分析

荆丹清 陈玉静 尹士男 贾 喆

解放军总医院第一附属医院内分泌科，北京 100048

三种方法测定糖化血红蛋白的一致性和可靠性分析

荆丹清 陈玉静 尹士男 贾 喆

解放军总医院第一附属医院内分泌科，北京 100048

目的探讨微粒色谱法、亲和层析法与高效液相色谱（HPLC）法测定糖化血红蛋白（GHb）的一致性和可靠性。 方法 选取2014年6～9月在解放军总医院第一附属医院门诊及住院治疗的137例糖尿病患者为研究对象，空腹抽取双份全血标本。利用微粒色谱法、亲和层析法及HPLC法分别测定糖化血红蛋白A1（HbA1c），每份标本测定2次。将入组的137例糖尿病患者参照HPLC法测定的HbA1c为金标准分为3组：第1组HbA1c含量 ≤6.5%；第2组6.5%＜HbA1c含量 ＜7.5%；第3组HbA1c含量≥7.5%，分析各组人群采用的3种不同检测方法组间差异是否有统计学意义。以Bio-Rad D10 HPLC测定的GHb为目标系统，以微粒色谱法和亲和层析法为试验系统，建立回归方程，分析试验系统与目标系统检测结果的偏差程度。 结果3种方法测定HbA1c值组内比较差异无统计学意义（P＞0.05）；回归分析显示，微粒色谱法与HPLC法所测的HbA1c值呈良好的线性关系，Y=1.006 X +0.213，相关指数r2=0.885；层析法与HPLC法测定结果亦呈良好的线性关系，Y=0.923 X+0.338，相关指数r2= 0.917；对于不同的糖尿病人群，3种方法检测结果亦呈现良好的相关性。 结论微粒色谱法和亲和层析法均能为临床提供与HPLC法所测糖化血红蛋白偏差较小的可靠数据，检验结果可被临床接受。微粒色谱法操作简单、快速，可为临床快速诊断提供方便。

糖化血红蛋白；离子交换高效液相色谱法；微粒色谱法；亲和层析法

糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）是血红蛋白与糖类非酶促结合的产物，它的合成缓慢而且是不可逆的。它反映3个月左右的平均血糖水平，克服了饮食时间、空腹时间、服药时间的干扰，在患者血糖或尿糖波动较大时有特殊意义[1]。糖化血红蛋白A1（HbA1c）在糖尿病的筛选、制订糖尿病患者的治疗方案及对血糖控制水平的评价上有很高的临床价值[2-3]。HbA1c的检测方法很多，目前，临床上通用的HbA1c检测的金标准是非多孔阳离子交换柱的高压液相层析法，但因仪器价格昂贵基层医院不能普及，而且检测时间较长，操作复杂，不能满足门、急诊患者的要求。寻找更加方便、快速、准确检测HbA1c的方法就显得尤为重要。本研究对137例糖尿病患者分别采用3种方法测定HbA1c（亲和层析法测定的是糖化血红蛋白总量），旨在比较3种检测方法所测HbA1c的可靠性、操作的方便性及快捷性。本组数据显示，NycoCard readerⅡ床旁HbA1c分析仪采用微粒色谱法（小旋风）以及用亲和层析法与传统的高效液相色谱（HPLC）法所测数据均有良好的相关性，且微粒色谱法的优势是较亲和层析法操作简单、快捷，适合床旁患者快速检测，现将试验结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年6～9月于解放军总医院第一附属医院（以下简称“我院”）内分泌门诊及内分泌科住院治疗的137例糖尿病患者为研究对象，其中男71例，女66例，年龄23～87岁，平均（57.3±28.9）岁，患者糖尿病史0.5～51年。检测前经医院伦理委员会批准，并由患者签订知情同意书。

1.2 仪器与试剂

目标系统检测方法为离子交换HPLC法，利用Bio-Rad D10糖化血红蛋白测定仪（北京市卫生部临床检验中心质检合格）测定HbA1c；试验系统为微粒色谱法和亲和层析法，微粒色谱法利用 NycoCard READERⅡ特种蛋白金标检测仪（小旋风），亲和层析法利用Premier Hb9210糖化血红蛋白测定仪测定糖化血红蛋白，对比其差异结果。试剂为实验室常规的检测试剂，经临床实验证实有良好的稳定性。

1.3 检测方法

137例患者清晨抽取静脉血2 mL各2份，EDTA-K2抗凝。由3名技师分别负责3种仪器对标本进行检测，检测方法严格按照检测程序说明进行。全组中根据Bio-Rad D10测定的糖化血红蛋白值将患者分为3组：HbA1c含量≤ 6.5%、6.5%＜HbA1c含量＜7.5%、HbA1c含量≥7.5%，分析各组人群采用的3种不同检测方法组间差异是否有统计学意义。以Bio-Rad D10糖化血红蛋白测定仪测定的糖化血红蛋白为目标系统（临床检测的金标准），以微粒色谱法和亲和层析法为试验系统，建立回归方程，分析试验系统与目标系统检测结果的偏差程度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对所测数据进行处理和分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间及组内比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组检测标本数量

全组3种仪器各检测274例标本（每例抽取2份等量全血，抗凝），HbA1c含量为4.3%～12.8%，其中3例微粒色谱法检测HbA1c无读取结果（亲和层析法显示糖化血红蛋白总量＞19%），其他数据均在仪器可读范围之内，故3例标本作废。实际检测患者例数为134例，其中 HbA1c≤ 6.5%的患者38例，6.5% ＜HbA1c含量＜7.5%的患者45例，HbA1c含量≥7.5%的患者51例。

2.2 HbA1c浓度测定结果

采用3种不同的方法在HbA1c含量≤6.5%的人群、6.5%＜HbA1c含量＜7.5%的人群、HbA1c≥7.5%的人群中检测HbA1c的浓度，经方差分析组内比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3种方法测定HbA1c含量组内比较（%）

2.3 3种不同方法测定HbA1c之间的相关性

采用SPSS 20.0统计软件将HPLC法所测HbA1c含量为目标值与微粒色谱法、层析法所测HbA1c含量为试验值进行一元线性回归后，微粒色谱法与HPLC法数据分析的相关回归方程为Y=1.006 X+0.213，相关指数r2=0.885；层析法与HPLC法数据分析的回归方程Y=0.923 X+0.338，相关指数r2=0.917。微粒色谱法、层析法与HPLC法所测数据存在良好的相关性。见图1。

图1 3种方法测定HbA1c的相关性比较

2.4 HbA1c回归分析

在3组不同HbA1c含量≤6.5%、6.5%＜HbA1c含量＜7.5%、HbA1c含量≥7.5%人群中，采用SPSS 20.0统计软件将HPLC法所测HbA1c含量为目标值，与微粒色谱法、层析法所测数据为试验值分别进行一元线性回归后，数据显示对不同的糖尿病人群，3种方法检测结果呈现良好的相关性。回归方程见表2。回归散点图见图2～4。

3 讨论

糖尿病的发病机制尚未完全明了。血糖易受饮食、运动、时间、情绪的影响，而且只能反映患者即时的血糖水平和当时的身体状况。因此，临床上血糖不作为评价疾病控制程度的标准。GHb是血红蛋白与葡萄糖结合后的产物占全部血红蛋白的比例，HbA1c是红细胞中血红蛋白与葡萄糖缓慢、持续且不可逆进行非酶促蛋白糖化反应的产物[4]。HbA1c的最大优势在于其不受血糖浓度即时波动的影响，根据HbA1c含量可推算出测定前8～12周的平均血糖水平[5-6]。2010年，在美国糖尿病协会发布的《糖尿病诊疗指南》中，已将HbA1c含量＞6.5%优先作为诊断糖尿病的标准[7]。因此，国内学者也逐渐将HbA1c的检测作为筛选、诊断、监控糖尿病人群的有效指标[8-9]。

表2 不同人群用3种方法测定HbA1c含量的回归分析

图2 HbA1c含量≤6.5%人群用3种方法测定HbA1c含量的相关性比较

图3 6.5%＜HbA1c含量＜7.5%人群用3种方法测定HbA1c含量的相关性比较

图4 HbA1c含量＞7.5%人群用3种方法测定HbA1c含量的相关性比较

本研究随机选取了我院内分泌门诊和在内分泌病区住院的137例2型糖尿病患者为研究对象，为了保证试验的合理性、减少误差以及获得更多检测的样本，共获得274份标本（每例抽取2份等量全血，EDTA-K2抗凝），涵盖了＞23岁各年龄段的人群，病史包括初发糖尿病患者，又有糖尿病病史长达51年的患者。仅3例患者血清采用NycoCard readerⅡ床旁HbA1c分析仪（微粒色谱法）的数据无法读取，超过了该系统测量线性范围的3%～18%。其他标本均被仪器接受，将3对标本移除后有效标本为268例。根据HPLC法测定的糖化血红蛋白值将患者分为3组：HbA1c含量≤6.5%的患者38例；6.5%＜HbA1c含量＜7.5%的患者45例；HbA1c含量≥7.5%的患者51例，分组的标准是基于2010年美国糖尿病学会将HbA1c作为诊断糖尿病的标准，诊断切点确定为6.5%[8，10]。研究结果显示：①各组人群采用3种不同的检测手段，所得数据组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），3种检测方法所测结果一致、可靠。②全组利用微粒色谱法所测HbA1c数据与HPLC法有良好的相关性，Y= 1.006 X+0.213，相关指数r2=0.885。亲和层析法与HPLC法测定结果亦呈良好的线性关系Y=0.923 X+ 0.338，相关指数r2=0.917，说明本试验从对象的筛选、血标本的采集、血标本的储存、血浆的分离以及整个检验过程合理、可信。③在不同HbA1c含量的人群中，3种方法检测结果之间呈现良好的相关性。当然，3种检测方法亦存在微小偏差（相关指数达到0.999以上为完全相关），但仍显示相关良好，可被临床接受，证实糖化血红蛋白的浓度大小不影响3种仪器的检测结果。

3种检测方法各有优缺点：①临床上普遍认为HPLC法测定HbA1c准确、可靠，是检测HbA1c的金标准，相关的仪器设备价格昂贵，基层医院普及困难。而且HPLC法操作复杂、成本高、测定时间长，需将标本收集起来成批检测，医生和患者无法得到即时的检测报告，不利于门急诊及临床科室危急患者病情的监测[11]。②新型的 NycoCard readerII床旁 HbA1c分析仪检测仪已通过欧洲糖化血红蛋白参比实验室（ERL）的鉴定和美国FDA的认证，仪器价格低廉。其采用微粒色谱法，操作简便、全血量5 μL、检测速度仅需4～5 min，能满足基层医院门急诊或临床科室的使用。从本组的测量结果看，与HPLC法的检测结果一致，组间比较差异无统计学意义。③亲和层析法检测的是糖化血红蛋白总量，亦需成批检测，检测结果与HPLC法比较差异无统计学意义，亦可作为糖尿病监测的理想方法[12-13]。

研究显示，血糖与HbA1c呈正相关，HbA1c越高表明血糖与血红蛋白结合的就越多，病情没有得到很好的控制[14-16]。HbA1c虽然反映了一个阶段的平均血糖水平，但它并不能代替每日饮食前后的血糖监测，医生根据患者的病史、饮食、运动等情况结合即时的血糖水平调整药物，HbA1c结合血糖的监测，可以为糖尿病患者指导更加适合的诊疗方案并给出个体化的健康指导。如果单纯地将HbA1c作为诊断糖尿病的诊断依据仍有明显的不足[17]，血液透析、慢性溶血性贫血、脾功能亢进的患者则不能单用HbA1c的检测结果判定是否诊断为糖尿病。所以，HbA1c检测时需询问病史，排除慢性疾病的影响。有学者建议，如果糖尿病患者血糖近期控制得很好，血糖平稳在5.5～6.5 mmol/L，那么每年可检测2～3次HbA1c；而对于那些正在进行胰岛素治疗的患者或近期血糖控制不稳定的患者，建议3～4个月进行一次HbA1c检测[18]。

本研究证实了新型的床旁HbA1c分析仪测定HbA1c的可靠性，微粒色谱法、亲和层析法可作为高效液相色谱测定HbA1c的有效补充。其操作简单、快捷，适合门、急诊及床旁患者快速检测。

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Analysis on the consistency and reliability of glycated hemoglobin tested by three different methods

JING Danqing CHEN Yujing YIN Shinan JIA Zhe
Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China

Objective To discuss the consistency and reliability of Glycated hemoglobin determined by particles of chromatography,affinity chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC)method.Methods 137 diabetics received ambulatory treatment or hospitalized in the First Affiliated Hospital of PLA General Hospital from June 2014 to September 2014 were selected as research objects,they were drew fasting double whole blood sample. Particles of chromatography,affinity chromatography and HPLC method was separately used to determine glycated hemoglobin A1(HbA1c).Each specimen was measured twice.Taking HbA1ctest by HPLC as gold standard,137 diabetics were divided into three groups:group one(HbA1clevel≤6.5%),group two(6.5%＜HbA1clevel＜7.5%)and group three (HbA1clevel≥ 7.5%).Whether there was statistical difference among three groups was analysed.Taking HbA1ctest by Bio-Rad D10 HPLC method as target system,particles of chromatography and affinity chromatography as testing systems,regression equation was established,the degree of deviation between the results of target system and testing system was analysed.Results There was no significant difference in results of HbA1c among 3 methods(P＞0.05).Regression analysis showed that two methods had a good linear relationship between particles of chromatography and HPLC method,Y=1.006 X+0.213,r2=0.885;There was also a good linear relationship between affinity chromatography and HPLC method,Y=0.923 X+0.338,r2=0.917.The results of three methods showed good correlation to different diabetics.Conclusion Both particles of chromatography and affinity chromatography can offer reliable data of small deviation for clinic,compared to HPLC method.The results can be accepted by clinic.Particles of chromatography is simple and fast to operate,which can provide convenience for clinical rapid diagnosis.

Glycated hemoglobin;Ionic exchange high performance liquid chromatography;Particles of chromatography;Affinity chromatography

R331.1+41

A

1673-7210（2015）11（c）-0091-04

2015-08-06本文编辑：赵鲁枫）

解放军总医院科研课题项目（201405）。

荆丹清（1971-），女，医学博士，副主任医师，主要从事糖尿病、甲亢、骨质疏松等内分泌疾病的诊治。