山羊硬脊膜的微观形貌及三维结构特征

于凤宾 岑 莲 廖新远 陈德玉

·论著·

山羊硬脊膜的微观形貌及三维结构特征

于凤宾 岑 莲 廖新远 陈德玉

目的获取山羊硬脊膜形貌及三维微观结构特征，为构建与之空间结构近似的人工硬脊膜提供相关资料。方法山羊硬脊膜取材后，进行标本处理及大体观察，光镜、扫描电镜及透射电镜观察微观结构、组织学成分、内外表面形貌、胶原纤维直径、分布以及分布模型。结果大体观察可见硬脊膜为一乳白色、质韧、弹性半透明膜；光镜下观察硬脊膜的组成主要由“取向性”结构的胶原纤维及少量散在分布的成纤维细胞组成；扫描电镜观察显示，其内外表面如连绵山峰状隆起；透射电镜见胶原纤维有序分布，胶原纤维的平均直径为（627±60）nm，且呈现双峰分布。结论山羊硬脊膜是主要由纳米级的“取向性”胶原纤维及散在分布的成纤维细胞组成的半透明薄膜。

硬脊膜形貌三维结构

硬脊膜损伤（撕裂或缺损）常见于脊柱外科及神经外科，处理不当可引发一系列并发症，严重时可危及生命。对于硬脊膜缺损，目前临床上多采取硬脊膜替代材料进行修补，然而由于现有硬脊膜替代产品均无模仿天然硬脊膜结构的设计理念，虽能成功修复缺损，但不能实现真正意义的硬脊膜再生。因此，有必要明确硬脊膜的空间结构及表观形貌特征，并以此构建与之空间构象近似的替代材料，这也是本实验的目的。实验山羊硬脊膜表观形貌和三维结构的获取主要依靠山羊硬脊膜组织标本的大体观察、组织学染色光镜观察、扫描电镜及透射电镜等微观层面的多角度观察。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、设备

动物实验手术台（上海医疗器械厂）；骨科后路减压手术器械及眼科手术器械（上海金钟医疗器械厂）；TPl0 20自动脱水机，EGl600包埋机，UL-TRACUTR超薄切片机（莱卡公司，德国）；CM-120透射电镜荷兰，XL-30扫描电镜荷兰（PHILIPS公司，荷兰）。

1.2 标本取材

选取成年山羊一头，臀部注射麻醉药物速眠新（0.1 mL/Kg）和氯胺酮（6 mg/Kg）行联合麻醉。麻醉后，电动脱毛机去除腰背部毛发，纵向范围从下胸椎至腰骶部，横向范围为正中线至两侧约10 cm。山羊俯卧位并固定于动物手术台，头架固定头颅，新洁尔灭消毒液消毒术区3遍，铺无菌手术单，并以丝线缝合固定术缘皮肤及手术单。以L4为中心，作后正中切口，长约8 cm，依次切开皮肤、皮下组织、剥离L3-L5棘突及椎板附着的韧带、肌肉组织。咬骨钳咬除L4棘突及全椎板，此时可见硬脊膜表面覆被一层较厚的脂肪组织，用显微镊子将椎管内脂肪组织清除干净，暴露硬脊膜囊。于硬脊膜囊正中点用显微镊轻轻夹起，避免夹伤脊髓组织，用弧形眼科剪刀剪取0.8 cm×0.5 cm大小硬脊膜缺损，可见清晰的脑脊液从缺损区流出。

1.3 大体观察

对切取的硬脊膜标本进行大体观察。

1.4 组织学观察

将切取的硬脊膜标本进行脱水、固定、包埋，切成5 μm厚的切片，行HE染色，观察胶原纤维、细胞分布及排列情况。

1.5 扫描电镜（SEM）观察

羊自体硬脊膜标本固定，磷酸缓冲液漂洗，乙醇梯度脱水，乙醇浓度依次为25%、50%、75%、85%、95%和100%，每个浓度脱水5 min，临界点干燥仪进一步干燥脱水。导电胶固定，喷金，行扫描电镜观察，以明确山羊硬脊膜的表观形貌。

1.6 透射电镜（TEM）观察

将硬脊膜标本置于2%戊二醛固定液行预固定（4℃，2 h），磷酸缓冲液冲洗2次，每次10 min，置入1%锇酸固定液（4℃，2 h），磷酸缓冲液冲洗2次，每次10 min，标本经梯度乙醇逐级脱水，每次10 min，环氧丙烷置换2次，每次10 min，环氧树脂812与环氧丙烷（1∶1）浸透2 h，环氧树脂812与环氧丙烷（2∶1）浸透过夜，纯环氧树脂812浸透6 h，置60℃烘箱内48 h，制备超薄切片，经枸橼酸铅电子染色后，行TEM观察。

TEM主要观察胶原纤维的分布及直径。采用KS400图像分析软件（3.0版，德国）测量胶原纤维横截面直径，每组随机测量100根胶原纤维，计算其平均值和标准差。

2 结果

2.1 硬脊膜大体观察

大体观察可见硬脊膜为一半透明的薄膜，呈乳白色，质地较韧，有弹性，切取离体后明显回缩，内表面及外表面（脑脊液侧与背离脑脊液侧）外观上无明显差异，表面未见明显的血管分布。

2.2 组织学观察结果

光学显微镜下观察可见硬脊膜主要由胶原纤维及散在分布的成纤维细胞组成，胶原纤维组成纤维束，有“取向性”排列，纤维束并不呈完全线性形态，而呈波浪形，部分区域可见由多个密集的纤维丝组成的粗大纤维束，少量的成纤维细胞散在分布于胶原纤维中，主要位于胶原纤维的束与束之间（图1）。

图1 山羊硬脊膜组织学观察（HE染色）Fig.1 Histological observation of goat spinal dural (HE staining)

2.3 SEM观察结果

SEM下观察可见硬脊膜内表面（脑脊液面）、外表面（背离脑脊液面）表观形貌高度相似，并非如肉眼所见的表面那样光滑平整，而是呈现为胶原纤维构成的众多条索状隆起，且连綿不断，极似重峦叠嶂的山峰，胶原纤维束之间可见散在分布的棱形成纤维细胞（图2）。

图2 山羊硬脊膜SEM观察结果（标尺=20 μm）Fig.2 SEM observation of goat spinal dural(Scale=20 μm)

2.4 TEM观察结果

TEM下观察硬脊膜横截面图可见胶原纤维呈圆形或椭圆形，呈规律性排列。纵切面图可见胶原纤维呈长条形，呈有序排列，每条胶原纤维中又可见垂直于胶原纤维走向的明暗交替的周期性横纹（图3）。胶原纤维的直径介于400～1 000 nm之间，平均（627±60）nm（图4）。

图3 山羊硬脊膜TEM观察结果（标尺=500 nm）Fig.3 TEM observation of goat spinal dural(Scale=500 nm)

图4 羊硬脊膜胶原纤维直径分布图Fig.4 The diameter distribution of collagen fibers of goat spinal dural

3 讨论

既往研究发现硬脊膜具有不可再生性[1]，硬脊膜缺损后无自我愈合能力，其愈合过程主要依靠其邻近软组织而非硬脊膜裂口周缘的成纤维细胞的增生和胶原纤维的沉淀，从而形成瘢痕组织，并与周围组织发生严重黏连。目前，临床上对于硬脊膜缺损的治疗，大多主张硬脊膜替代材料进行修补，同时辅以密封剂封闭针孔[2]。明胶海绵、胶原蛋白、异体心包或小肠、血管补片、脂肪或筋膜移植和人工合成高分子材料等[3-7]均曾作为硬脊膜替代材料应用于临床。

本研究发现硬脊膜主要是由胶原纤维及少量的成纤维细胞组成的半透明薄膜，胶原纤维呈“取向性”排列，成纤维细胞分布于胶原纤维中，微观下可见硬脊膜内外表面呈连綿不断的山丘状隆起。而前面提及的所有硬脊膜替代材料均无模仿天然硬脊膜结构的设计理念，故无法实现真正意义的硬脊膜再生。

要想实现硬脊膜的再生，必须先明确硬脊膜的空间结构及表观形貌特征，并以此构建与之空间构象近似的替代材料。所以本实验利用组织学观察、扫描电镜及透射电镜等研究羊硬脊膜正常微观结构、组织学成分、内外表面形貌、胶原纤维直径和分布以及分布模型，为制备与山羊硬脊膜三维结构相似的硬脊膜再生材料提供相关资料支持。

[1]郑旭为,刘忠军.人工硬膜修补硬脊膜及预防椎管内粘连的实验观察[J].中国脊柱脊髓杂志,2006,16(1):52-56.

[2]Gazzeri R,Neroni M,Alfieri A,et al.Transparent equine collagen biomatrix as dural repair.A prospective clinical study[J].Acta Neurochir(Wien),2009,151(5):537-543.

[3]Zhang X,Gao X,Jiang L,et al.Flexible generation of gradient electrospinning nanofibers using a microfluidic assisted approach [J].Langmuir,2012,28(26):10026-10032.

[4]Hashi CK,Zhu Y,Yang GY,et al.Antithrombogenic property of bone marrow mesenchymal stem cells in nanofibrous vascular grafts[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(29):11915-11920.

[5]Xie J,Macewan MR,Ray WZ,et al.Radially aligned,electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications[J].ACS Nano,2010,4(9):5027-5036.

[6]Kurpinski K,Patel S.Dura mater regeneration with a novel synthetic,bilayered nanofibrous dural substitute:an experimental study[J].Nanomedicine(Lond),2011,6(2):325-337.

[7]白万山,王新伟,袁文,等.聚乳酸-羟基乙酸共聚物/I型胶原/壳聚糖人工硬脊膜在兔脊髓损伤模型中的应用[J].中国组织工程研究,2012,16(3):471-474.

Morphology and Three-dimensional Structure Characteristics of Goat Spinal Dural

YU Fengbin1,CEN Lian2,LIAO Xinyuan3,CHEN Deyu3.1 Department of Orthopaedics,98 Hospital of PLA,Huzhou 313000,China;2 School of Chemical Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;3 Department of Spine Surgery, Shanghai Changzheng Hospital,Shanghai 200003,China.Corresponding author:CHEN Deyu(E-mail:deyuchen514@yahoo. com).

ObjectiveTo obtain the morphology and three-dimensional structure characteristics of goat spinal dural and provide information for reconstructing artificial spinal dural.MethodsThe specimens of spinal dural were obtained to observe the microstructure,surface morphology,histology,collagen fiber diameter,distribution and distribution model through naked eyes,light microscope,scanning electron microscope(SEM)and transmission electron microscope(TEM).Results The spinal dura looked like a milky white,translucent,flexible and elastic membrane.It was mainly composed of oriented collagen fibers while fibroblasts line sparsely along those fibers.Its inner and outer surfaces looked like mountain peaks through SEM observation.It was revealed by TEM that collagen fibers distribute orderly with an average diameter of(627±60)nm. The diameters of collagen fibers exhibited a bimodal distribution.ConclusionThe goat spinal dura is a translucent membrane which is mainly composed of nanoscale oriented collagen fibers and sparsely scattered fibroblasts.

Spinal dura;Morphology;Three-dimensional Structure

Q813.1+2

A

1673－0364（2015）05－0289－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.05.001

2015年6月4日；

2015年6月21日）

上海市科委医学重点项目（12411950700）。

313000浙江省湖州市中国人民解放军第九八医院骨科（于凤宾）；200237上海市华东理工大学化工学院（岑莲）；200003上海市上海长征医院脊柱外科（廖新远，陈德玉）。

陈德玉（E-mail：deyuchen514@yahoo.com）。