秋水仙素诱导千斤拔四倍体效果研究

苏钰琴++蒋向军++莫燕兰++李翠兰++盘飞兰

摘要 以桂优蔓性千斤拔种子苗为外诱导材料，采用秋水仙素进行多倍体离体诱导。结果表明，0.10%秋水仙素处理10 h，诱导率可达到20.0%，效果最好。四倍体植株相对粗壮，叶片大而厚实且皱，可作为四倍体的辅助筛选。

关键词 千斤拔；种子苗；秋水仙素；四倍体；染色体检测

中图分类号 Q949.753.3；S567 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）17-0087-02

千斤拔为豆科千斤拔属植物Moghania philippinens（Merr.et Rolfe）Li.的根，为《中华人民共和国药典》（2005年版））附录Ⅲ收载[1]。别名蔓千斤拔、吊马桩、吊马墩、一条根、老鼠尾、钻地风（四川）等，以根入药。我国云南、四川、贵州、湖北、湖南、广西、广东、海南、江西、福建和台湾各省区均有分布[2]。主治风湿骨痛、腰肌劳损、慢性肾炎、跌打损伤、痈肿、偏瘫、阳痿、妇女白带多等症，是妇科千金片、金鸡冲剂、壮腰健肾丸等中成药的主要原料药[3-5]。已有的研究表明，千斤拔皂苷对修复神经损伤、治疗老年性痴呆、抗炎镇痛、增强免疫、抗疲劳、抗缺氧有明显作用，中国医科院、中国药科大学等都设置了专门的新药研究课题，澳大利亚等国已进入药理试验阶段。现有常规二倍体千斤拔药材的单株产量较低，根部纤维含量较高，不利于其中有效成分的提取。

通过倍数性育种手段使千斤拔基因组多倍化，可以获得株型大、药材产量高、出膏率高的品种。目前尚未发现有多倍体千斤拔及其培育方法的相关报道。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 外植体。桂优蔓性千斤拔优良品种所结实的饱满种子。

1.1.2 培养基。种子萌发培养基为1/2MS+0.2%活性炭，增殖培养基为MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+糖3%+琼脂5%，生根培养基1/2MS+NAA 0.5 mg/L+糖3%+琼脂5%+0.2%活性炭，pH值均为5.8。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的准备。选取桂优蔓性千斤拔优良植株所结实的饱满种子，在超净工作台上先用75%酒精处理30 s，再用0.1%升汞处理5～8 min，最后用无菌水冲洗4～6次，用经过灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分，将种子转接到MS+0.2%活性炭培养基中。

1.2.2 秋水仙素处理。采用过滤灭菌配制浓度分别为0.05%、0.10%、0.15%的秋水仙素溶液，将萌发的健壮种子苗进行暗培养7 d后，放到秋水仙素溶液中分别培养5、10、15 h后，以浸泡无菌水作为对照组，每个组合处理30株种苗。将苗用无菌水洗干净，转接到增殖培养基中进行培养。培养40 d后开始萌发新芽，在超净工作台上将诱导后长出的新芽转接到生根培养基中。

1.2.3 气孔鉴定。取同一生长时期的叶片，用解剖针在叶片的下表面取一小片白色薄膜，放在载玻片的水滴中，展平，盖上盖玻片，显微镜观察。

1.2.4 染色体检测。取目标植株的根尖、茎尖0.5～2.0 cm，固定液（甲醇∶乙酸=3∶1）处理15 min以上，流动水冲洗15 min，解离液（浓盐酸∶95%酒精=1∶1）处理2～10 min，流动水洗15 min以上，剪取0.1 mm分生组织用卡宝品红染色后压片，显微镜检、拍照，观察染色体数目。

2 结果与分析

2.1 多倍体诱导

从表1可以看出，随着秋水仙素浓度的提高和处理时间的延长，处理材料受抑制程度大，当秋水仙素溶液浓度为0.15%，处理时间为15 h时，处理材料仅有15%的存活率，多数处理材料由于受到秋水仙素的毒害作用，虽转入了增殖培养基中，但慢慢褐化失去活力。

浓度过高或过低多倍体诱导率都有所降低。在高浓度下，处理时间越长，材料存活率越低，因此秋水仙素浓度和处理时间要合理的搭配才能提高诱导率。对照组未发现有多倍体植株，说明秋水仙素有效诱导了多倍体千斤拔的产生。由此得出：0.10%秋水仙素处理10 h，诱导率可达到20.0%，效果最好。

2.2 气孔观察

取同一生长时期的叶片，在相同放大倍数下观察到四倍体千斤拔植株的气孔明显比二倍体植株的大（图1）。

2.3 四倍体千斤拔形态学特征

四倍体千斤拔植株的外观形态和二倍体有明显差异（图2），株型较大，生长旺盛，叶片大而厚实且皱，茎杆比较粗壮；而二倍体植株和叶片小而平整，且较薄，茎杆较细。

2.4 四倍体千斤拔染色体鉴定

采用压片法对再生植株进行染色体检测（图3），结果表明，经过秋水仙素诱导后的部分再生植株的染色体2n=4x=44，为四倍体；未经任何处理的二倍体植株染色体数2n=2x=22。

3 结论与讨论

染色体检测比较费时，处理植株数量很大时，很难做到每个植株都检测。因此，先通过外观筛选出株型较大、叶片厚且皱、茎杆粗壮的为目标植株，再对目标植株进行染色检测，最终筛选出四倍体植株。

秋水仙素有剧毒，在组织培养的过程中对外植体有毒害的作用，明显地抑制不定芽的分化甚至导致外植体的死亡，这与郑永强等[6]的结论相同。千斤拔植株对秋水仙素较敏感，经过秋水仙素诱导的材料转接到增殖培养基上，极易发生褐化现象，最后慢慢枯死。后面可以进一步研究其他多倍体诱变剂对千斤拔诱导的效果，或是添加其他物质能够不影响秋水仙素诱导效果的前提下降低其多诱导材料的毒害作用。

4 参考文献

[1] 国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2005.

[2] 许鸿源，梁琼月，周凤珏，等.蔓性千斤拔的快速繁育[J].种子，2010，29（2）：89-91.

[3] 饶伟文，黄建楷，温志芳，等.千斤拔的品种调查与质量研究[J].中草药，1999，30（3）：219.

[4] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准（1990年版）[S].南宁：广西科学技术出版社，1992：297.

[5] 张丽霞，彭建明，马洁.千斤拔研究进展[J].中药材，2007，30（7）：887-890.

[6] 郑永强，徐坤.秋水仙素在植物体细胞染色体加倍中的应用研究进展[J].中国农学通报，2003，19（5）：89-91.endprint