球形芽孢杆菌C3—41菌株铵盐利用特性及铵转运蛋白质分析

梁运改 江莹 金琪 蔡亚君

摘要：对球形芽孢杆菌（Lysiniacillus sphaericus）C3-41在不同铵盐浓度中的生长进行了研究。结果表明，在铵盐浓度为0.5～4.0 g/L范围内时，菌株正常生长并形成毒素，但是芽孢形成时间随铵盐浓度的升高而提前。从该菌株中提取基因组DNA，通过PCR的方法克隆了其基因组中疑似铵转运蛋白质的编码基因amt基因序列（GeneID： 501248970）。为了研究amt基因在T7启动子启动下的表达，构建了表达质粒pETAMT并转化进大肠杆菌中，对得到的重组菌株进行活性分析。结果表明，重组菌株E-pETAMT与对照菌株E-pET28a相比具有明显的将铵盐转运进细胞内及将铵盐分泌到细胞外的活性，即表明该amt基因编码的蛋白质在重组菌株E-pETAMT中表达并表现出铵转运蛋白质的活性。通过KEGG软件对C3-41菌株氮代谢途径的分析表明，铵盐既用于其氨基酸的合成，也是部分氨基酸的代谢产物。

关键词：球形芽孢杆菌（Lysiniacillus sphaericus）；铵盐；铵转运蛋白质；活性；氮代谢

中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5240-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.010

Ammonium Utilitation and Ammonium Transporter Analysis of

Lysinibacillus sphaericus C3-41 Strain

LIANG Yun-gai， JIANG Ying， JIN Qi， CAI Ya-jun

（Environmental Engineering College， Wuhan Textile University， Wuhan 430073， China）

Abstract： The effect of ammonium on Lysiniacillus sphaericus C3-41 strain was studied， and the result showed that， at the concentration of 0.5～4.0 g/L，C3-41 strain grew in similar level and expressed binary toxins normally， but spores formed earlier at high concentration.The putative ammonium transporter encoding gene （amt， GeneID： 501248970） was cloned by PCR from Lysinibacillus sphaericus C3-41 genomic DNA. To express amt gene under T7 promoter （a vegetative promoter），the recombinant plasmid pETAMT was constructed and transformed into Escherichia coli BL21 strain. The generated recombinant strain E-pETAMT could transport ammonium into the cell and secrete ammonium to the extracellular. This result indicated that the protein encoding by amt gene had the activity of ammonium transporter. KEGG analysis of nitrogen metabolism for strain C3-41showed that ammonium could be used for amino acid synthesis，but also was the metabolite product of some amino acids.

Key words： Lysinibacillus sphaericus； ammonium； ammonium transporter； activity； nitrogen metabolism

氮素是所有生物体必需的营养物质，而铵离子是最容易被生物体吸收利用的氮源形式。铵离子在氮素代谢中有着重要地位，它既是生物体内所有氮源的最终代谢产物，同时也是生物体内合成的核酸、氨基酸和辅因子等含氮类化合物的底物，因此，在维持生物体内的氮素动态平衡中，相对稳定的铵离子库具有重要意义。铵转运蛋白质是一类存在于真核生物或原核生物细胞膜上的、能主动转运NH4+的载体，它可将细胞所处环境中的微量NH4+转运到细胞内成为其自身氮源，确保细胞内的NH4+浓度稳定和细胞代谢的正常进行。近年来，有关铵转运蛋白基因克隆及功能鉴定的研究已有较多报道，铵转运蛋白基因主要包括amtB、mep和rh三大类。其中mep基因主要分布在酵母中，rh基因主要分布在猕猴中，研究比较详尽的是amtB基因，分布在细菌、古生菌和真核生物中，在不同类群中高度保守。其中在细菌中主要分布于氨氧化细菌、雀稗固氮菌、巨胞氮单胞菌、敏捷氮单孢菌、谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌中[1]。

球形芽孢杆菌（Lysiniacillus sphaericus）C3-41菌株是中国科学院武汉病毒研究所虫媒病毒媒介控制学科组分离的一株对蚊幼虫高毒力的菌株，是中国第一个登记注册的微生物杀蚊剂商品制剂。但是该菌在生产时不能利用糖类物质，其生长和提供能量的碳源只能由富含氨基酸的含氮物质提供。国外多采用胨化牛奶、合成和半合成的培养基进行发酵生产，发酵成本高；而国内普遍采用的是由农副产品（黄豆粉、花生饼粉、棉子饼粉、玉米浸出液和鱼粉等）组成的培养基进行发酵，成本虽低，但由于其代谢过程中产生大量氨类物质，导致发酵液pH过高，影响菌株的生长和毒素的形成，发酵液的菌数和毒力均不高，也影响了该菌株作为安全高效的生物杀虫剂的大规模推广应用[2]。为研究该菌株对铵盐利用的特性，解决其发酵时易受氨类物质影响的问题，本试验首先研究了不同浓度铵盐对球形芽孢杆菌C3-41菌株的菌体生长、芽胞形成及毒素表达的影响；其次对2008年完成的球形芽孢杆菌C3-41菌株全基因组[3]测序中的铵转运蛋白的编码基因（初步命名为amt）进行了研究，将amt基因在T7启动子调控下进行了原核表达，并对表达产物是否具有铵盐转运及分泌的活性进行了分析；此外，通过KEGG软件对C3-41菌株的氮代谢途径进行了分析。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

球形芽孢杆菌C3-41菌株为中国科学院武汉病毒研究所虫媒病毒媒介控制学科组分离保藏，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21为笔者所在实验室保存菌株。LB培养基（每升含10 g 蛋白胨，5 g酵母粉，10 g NaCl）：氨苄青霉素和卡那霉素使用浓度分别为50 μg/mL 和30 μg/mL。G-Tris培养基：每100 mL含1 mL 0.8% CaCl2·H2O，1 mL 20% （NH4）2SO4（添加量可按试验需要变动），1 mL 20% 葡萄糖，5 mL 1 mol/L Tris-HCl pH 7.5，1 mL 5% K2HPO4，1 mL G-Tris盐母液（含0.025% FeSO4·H2O，0.05% CuSO4，0.05% ZnSO4·7H2O，0.5% MnSO4·H2O，2.0% MgSO4），0.15 g酵母粉，pH 7.4。

1.2 主要试剂与仪器

所用内切酶以及用于质粒提取、PCR产物回收和DNA片段快速纯化试剂盒均购自TaKaRa公司；其余常规试剂均为Sigma进口分装。主要仪器有美国Biotec synergy HT全波长自动酶标仪，美国ABI 9800 PCR 仪，电泳系统为美国BioRad DNA 电泳系统和蛋白质电泳系统。

1.3 不同铵盐浓度对球形芽孢杆菌C3-41菌株生长及毒素表达的影响分析

将菌株接入5 mL LB液体培养基，30 ℃、150 r/min培养过夜后按1∶100比例转接入含不同浓度（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L）（NH4）2SO4的G-Tris 培养基中，30 ℃、150 r/min培养，在培养的0、8、24、48、72、96 h取样。将样品置于4 ℃冰箱中保存，至取样完毕后对菌体生长状况、芽孢数及菌体二元毒素表达进行测定分析。

菌体生长状况分析方法：以吸光度表示菌体的生长状况，利用分光光度计测定样品在600 nm波长下的吸光度（OD600 nm），它是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。

芽孢计数方法：取100 μL样品离心，菌体用无菌水洗涤3次后加1 mL无菌水充分振荡摇匀，80 ℃水浴处理20 min，然后将浓度进行系列梯度（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）稀释，每个稀释浓度涂布3个LB固体平板，30 ℃培养过夜后对平板上长出的菌落进行计数。

二元毒素的表达分析方法：球形芽孢杆菌对蚊幼的毒力主要依赖于在芽孢期产生的二元毒素。二元毒素是由等量的41.9 ku BinA和51.4 ku BinB蛋白质多肽组成，二者的同时存在是形成伴孢晶体所必需的，缺一不可。对菌株二元毒素表达的分析通过SDS-PAGE电泳进行。SDS-PAGE分析方法参照文献[4]。

1.4 DNA的提取

大肠杆菌质粒DNA提取参照文献[4]小量碱法进行。芽孢杆菌菌株的总DNA提取参照蔡亚君等[5]的方法进行提取。

1.5 几丁质酶基因的PCR扩增

根据Genbank中球形芽孢杆菌C3-41菌株的铵转运蛋白质基因amt的ORF（GeneID：501248970）全序列设计了扩增引物，引物序列为：AMT1：5′-GGATCCGGGATGGAGGAAATAATATTATC-3′（下划线为BamHⅠ酶切位点），AMT2：5′-GTCGACGGGTTATATGTGTTGTTCTTCTTG-3′（下划线为SalⅠ酶切位点）。扩增体系为：芽孢杆菌总DNA 0.1 μg，10×PCR reaction buffer 2.5 μL，2.5 pmol dNTPs，Taq DNA polymerase 1 U，引物各10 pmol，加ddH2O至25 μL。扩增程序为：94 ℃变性30 s，60 ℃退火90 s，72 ℃延伸3 min，循环30次；72 ℃延伸7 min。

1.6 用于amt基因原核表达的重组质粒的构建

以球形芽孢杆菌C3-41菌株总DNA为模板，AMT1/AMT2为引物，PCR扩增得到amt基因ORF，其两端分别带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，PCR产物经PCR产物回收试剂盒纯化回收后进行BamHⅠ/SalⅠ双酶切。双酶切后的PCR片段与表达质粒pET28a BamH Ⅰ/Sal Ⅰ酶切后的片段连接，将连接产物转化E. coli BL21后在卡那霉素抗性LB平板上筛选克隆子，随机挑取菌落提取质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒即为amt基因在质粒pET28a T7启动子控制下表达的重组质粒，命名为pETAMT。

1.7 Amt蛋白质的表达及活性分析

将质粒pETAMT转化E. coli BL21，质粒经酶切验证后得到在T7启动子下表达Amt蛋白质的重组菌株E-pETAMT，同时将表达质粒pET28a转化菌株E. coli BL21后形成用于对照的重组菌株E-pET28a。

铵盐吸收试验：将重组菌株置于LB液体培养基中于37 ℃、200 r/min条件下进行活化培养，取1 mL培养液离心收集菌体；菌体用无菌水洗涤后转接入100 mL铵盐浓度分别为0.1、1.0、10.0 mmol/L的G-Tris培养基中，于37 ℃、200 r/min条件下进行培养，并于6、12、24 h时取样检测铵盐浓度。

铵盐分泌试验：将重组菌株置于LB液体培养基中于37 ℃、200 r/min条件下进行活化培养，取1 mL培养液离心收集菌体；菌体用无菌水洗涤后转接入100 mL不添加硫酸铵的G-Tris培养基中，于37 ℃、200 r/min条件下进行培养，并于6、12、24 h时取样检测铵盐浓度。

铵盐浓度测定通过纳氏试剂比色法[6]进行。

2 结果与分析

2.1 铵盐浓度对球形芽孢杆菌C3-41菌株生长及毒素表达的影响

2.1.1 铵盐浓度对C3-41菌株菌体生长的影响 在铵盐浓度为0.5～4.0 g/L范围内，不同铵盐浓度对培养基的初始pH影响不大，pH为7.5～8.0，在芽孢萌发的适合pH内[7]；加入C3-41菌液培养后，培养液的pH维持在7.0～8.5，也始终处于适合C3-41菌体生长的范围内（pH 3～9）[2]。对样品的生长状况检测结果（图1）表明，在铵盐浓度为0.5～4.0 g/L范围内，其所导致的培养基不同初始pH对C3-41菌体生长影响不大。在培养的0～8 h，菌体生长都处于延滞期；培养到8～24 h ，菌体生长开始进入对数生长期；到培养24 h以后，菌体生长均进入缓慢生长时期；在培养至96 h时，样品的OD600 nm取得最大值，分别为1.095、1.162、1.094、0.965、1.393。

2.1.2 铵盐浓度对C3-41菌株芽孢形成的影响 通过对C3-41菌株在含不同浓度铵盐的培养基中培养的不同时段的菌液中的芽孢进行计数，得到结果如表1所示。由表1可知，在含不同浓度铵盐的培养基中培养时，芽孢数均随着时间的延长而增加；且在相同时间段的样品中，芽孢数总体上随着铵盐浓度的增加而增加，铵盐浓度越高，芽孢形成的时间越早。

2.1.3 铵盐浓度对C3-41菌株二元毒素形成的影响 取100 μL C3-41菌株在不同铵盐浓度培养基中培养至96 h的菌液进行离心，并用无菌水洗涤菌体后进行SDS-PAGE电泳分析，结果（图2）表明，在0.5～4.0 g/L铵盐浓度范围内，不同浓度及其所导致的培养基不同初始pH对C3-41菌体二元毒素的形成没有显著影响，各样品的二元毒素都能正常表达，41.9 ku和51.4 ku蛋白质条带均可见。

2.2 Amt蛋白质的生物信息学分析

2.2.1 Amt蛋白质一级结构的预测 根据amt基因的氨基酸序列，通过蛋白质序列分析工具ProtParam（http：//www.expasy.ch/toots/protparam.html）分析Amt蛋白质的分子质量、理论等电点（pI）、氨基酸组成及半胱氨酸（Cys）数目、带正电荷的氨基酸（Arg+Lys）和带负电荷的氨基酸（Asp+Glu）数目。结果显示，蛋白质由433个氨基酸残基组成，分子质量为45 627.1 u，pI为5.40，含2个Cys，Arg+Lys为18个，Asp+Glu为28个。

2.2.2 Amt蛋白质二级结构的预测 采用ProtParam工具进行Amt蛋白质二级结构在线预测，结果显示，Amt蛋白质的二级结构中含有大量的α螺旋和无规则卷曲，α螺旋占48.27%，无规则卷曲占43.19%，延伸链占8.55%，无β转角。

2.2.3 Amt蛋白质跨膜区域预测 采用ProtParam工具进行Amt蛋白质跨膜结构在线预测，结果（图3）显示，Amt蛋白质有11个胞内向胞外的跨膜结构域和10个胞外向胞内的跨膜结构域。

2.2.4 Amt蛋白质序列分析 将amt基因翻译得到的Amt蛋白质序列与Genbank中其他铵转运蛋白质序列进行比对，结果显示球形芽孢杆菌的Amt蛋白质序列与芽孢杆菌属菌株Lysinibacillus fusiformis、Bacillus sp. B14905、L. boronitolerans、L. sphaericus、B. isronensis、B. licheniformis的Amt蛋白序列相似性分别为97%、96%、94%、89%、71%和61%，与2个Escherichia coli菌株的Amt蛋白质序列相似性均为 28%，结果见图4。说明该蛋白质种内差异性小，种间差异性大。

2.3 用于Amt蛋白质表达的重组菌株的构建

正确的克隆质粒经BamHⅠ/SalⅠ双酶切后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收amt基因片段（1 302 bp），与表达质粒pET28a BamHⅠ/SalⅠ酶切后的片段（5 369 bp）连接，连接产物转化E. coli DH5α后在卡那霉素抗性LB平板上筛选克隆子，随机挑取菌落提取质粒进行BamHⅠ/SalⅠ酶切鉴定，鉴定正确的质粒即为amt基因在质粒pET28a T7启动子控制下表达的重组质粒，命名为pEAmt，结果见图5。将质粒pEAmt转化入E. coli BL21，得到用于诱导表达的重组菌株E-pEAmt。

2.4 重组菌株的铵盐吸收测定

将重组菌株E-pEAmt和E-pET28a在分别含有0.1、1.0、10.0 mmol/L铵盐的G-tris培养基中，37 ℃、200 r/min条件下培养，于6、12、24 h取样检测OD600 nm及铵盐浓度，结果见表2。由表2可知，在含有铵盐的培养基中，在同样条件下培养时，菌株E-pEAmt的生长量明显高于菌株E-pET28a，表明菌株E-pEAmt比菌株E-pET28a能更好地利用铵盐用于菌体生长，且在0.1～10.0 mmol/L铵盐浓度范围内，铵盐浓度变化对菌体生长影响不大。在培养过程中，菌株E-pET28a培养液从培养6 h起即产生铵盐积累，比原始培养基中铵盐浓度显著提高，而菌株E-pEAmt培养液则在培养24 h时才出现少量铵盐积累。综合以上结果，表明菌株E-pEAmt通过amt基因的表达，具备了将铵盐转运进细胞内的功能。

2.5 重组菌株的铵盐分泌测定

将重组菌株E-pEAmt和E-pET28a在不添加硫酸铵的G-tris培养基中于37 ℃、200 r/min条件下进行培养，于6、12、24 h取样检测OD600 nm及铵盐浓度，结果（表3）显示，2个重组菌株生长量无显著差别，二者在培养初期都从培养基中吸收铵盐，使培养基中铵盐浓度降低，但随着培养时间的延长、菌体数量的增多，菌株E-pEAmt培养液中铵盐浓度增加，结合表2的结果，表明菌株E-pEAmt在培养初期利用培养基中的铵盐作为营养物质，而此后由于菌株的代谢又会产生大量铵盐，将铵盐分泌到细胞外。

3 讨论

在本研究中，首先对球形芽孢杆菌C3-41菌株在不同铵盐浓度的G-tris培养基中的生长及毒素表达进行了检测，结果显示，在含量高达4.0 g/L（约3 mol/L）的铵盐培养基中其菌体生长量基本不受影响，也能正常表达二元毒素，但是其芽孢的形成时间随铵盐浓度升高而提前。通过对球形芽孢杆菌C3-41菌株的全基因组测序结果分析，其中含有一个编码假定铵转运蛋白质的amt基因，本研究将amt基因在T7启动子下于大肠杆菌中表达，其重组菌株既能吸收铵盐，也能将铵盐由体内分泌到体外，表明该amt基因在C3-41菌株中编码的确实是铵转运蛋白质。通过KEGG软件对C3-41菌株的氮代谢途径进行分析，如图6所示，该菌株不能利用糖类物质（N-乙酰氨基葡萄糖除外）作为碳源，也不能利用无机氮作为氮源，只能利用氨基酸、蛋白质，其分析结果与之前对C3-41菌株营养需求的研究结果[8]基本一致。在该分析结果中，铵盐既用于合成氨基酸，也是多个氨基酸的降解产物，这也表明其菌体中铵转运蛋白质存在的必要性；另外发现，C3-41菌株能将铵盐合成缬氨酸和异亮氨酸，但这两种氨基酸却不能降解生成氨类物质。对球形芽胞杆菌C3-41菌株铵转运蛋白质及铵盐代谢的分析有助于指导其发酵工业生产。

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