HPLC法对钩藤超临界萃取物中钩藤碱的分析

曾启华 李森柱 王蒙 林锦良

摘要：通过超临界二氧化碳萃取技术（SFE-CO2）和高效液相色谱法（HPLC），以甲醇-水（70∶30，V/V）为流动相，对钩藤碱进行分析。研究表明，方法回归方程为y=7.000 0×10-8x-0.000 6（R2=0.994），即钩藤碱浓度在0.015～0.022 mol/mL内呈良好的线性关系。该分析方法快速、简单、灵敏，具有良好的准确度和精密度，可用于钩藤碱常规分析检验。

关键词：HPLC法；超临界萃取；钩藤[Uncaria rhynchophylla（Miq.）Jack.]；钩藤碱

中图分类号：O629.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5398-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.050

Study on the HPLC Method for Analysis of Rhynchophylline Extracted

from Uncaria tomentosa by Supercritical Fluid

ZENG Qi-hua1，2，LI Sen-zhu1，WANG Meng1，LIN Jin-liang1，2

（1.College of Chemical Engineering， Zunyi Normal College， Zunyi 563002， Guizhou， China； 2. Laboratory of Utilization Research on Characteristic Resources in Qianbei of Guizhou Province， Zunyi 563002， Guizhou， China）

Abstract：The analysis of rhynchophylline by the means of supercritical carbon dioxide extraction technology and high performance liquid chromatography （HPLC） analytic method with methanol and water （70∶30，V/V） as mobile phase. The results showed that regression equation for y=7.000 0×10-8x-0.000 6（R2=0.994）， and the linear relationship was good in the region of 0.015～0.015 mol/mL. The analysis method was rapid， simple， sensitive and has good accuracy and precision， can be used for routine analysis of rhynchophylline.

Key words：HPLC；supercritical fluid exaction； uncaria tomentosa；rhynchophylline

中草药材钩藤是茜草科茜草属钩藤[Uncaria rhynchophylla（Miq.）Jack.]、大叶钩藤（Uncariamacophylla Wall.）、毛钩藤（Uncaria hirsute Havil.）、华钩藤[Uncariasinensis（Oliv.）Havil.]或者无柄果钩藤（Uncaria sessilifmctus Roxb.）的带钩干燥枝茎[1]，始载于中古代医学典著《名医别录》，这味中药材在中国已有几十年研究历史。现代研究表明，其含吲哚类生物碱，如钩藤碱（rhynchophylline），异钩藤碱（iso-rhynchophylline）能够抑制外周血管收缩，降低血管阻力，降低血压，因此临床上广泛应用于抗高血压以及抗血栓形成和抗血小板聚集等病症的治疗[2-5]。

对于钩藤碱的有效提取方法，传统前处理方法中大多采用倒回流提取法[6]，目前只有少量关于超临界二氧化碳超临界萃取技术（SFE-CO2）在钩藤碱分离的应用报道。超临界萃取有速率快、易操作、温度低，保护热敏性物质、萃取物及其萃余物均无有机溶剂污染等优点。超临界状态下的二氧化碳对固态的物质有极强的穿透力，对芳香类化合物萃取性能强，所以超临界萃取技术在天然产物的有效成分及香精香料的提取方面具有广泛的应用[7]。

钩藤质量的评价标准多以钩藤碱和异钩藤碱的含量为指标。因此，建立便捷、准确的分析方法有助于钩藤药材的质量控制。有大量的文献报道了传统钩藤萃取液中分析钩藤碱（异钩藤碱）的方法，然而，对于超临界萃取物中的钩藤碱等的分析鲜见报道。本研究利用高效液相色谱法（HPLC）对超临界萃取物钩藤碱进行分析，为钩藤碱的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

STF-110超临界萃取仪（美国SUPERCRITICAL FLUID TECHNOLOGIES公司）；LC-20AD高效液相系统（日本SHIMADZU公司）；FA-JA型电子分析天平（上海越平仪器有限公司）；SB-5200型超声波提取仪（上海德洋意邦有限公司）。

1.2 试剂与材料

钩藤碱标准对照品（纯度≥99%），购于上海研晶生化试剂有限公司；甲醇为色谱纯（纯度≥ 99.9%），购自Yirenda Chemicals公司；超纯水（自制）；纯度为99.999%二氧化碳和氮气均由贵阳申建气体公司提供；无水乙醇，乙腈等试剂均为市售分析纯。

钩藤试样购于遵义康城医药有限公司，产于广西，打磨成约40目和20目粉末各500 g。

1.3 试验方法

1.3.1 钩藤碱标准溶液的制备 精密称取4.200 mg钩藤碱，置于10 mL 容量瓶中，无水甲醇定容，浓度为0.42 mg/mL的溶液，作钩藤碱标准对照液，静置0.5 h，经过0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液，备用。

1.3.2 制备样品 用SFE-CO2提取钩藤药品，萃取釜温度为40 ℃，背压阀温度为55 ℃；CO2流速为15 mL/min；夹带剂（无水乙醇）流速为15 mL/min。在压力2 000 kPa静态萃取30 min，动态萃取30 min[8]，进行2次超临界萃取所得，超声波辅助溶解于甲醇，备用。平均室温为19 ℃，平均湿度为47%。

1.3.3 样品溶液制备 精密称取0.100 g钩藤提取物细粉，置于10 mL容量瓶中，加无水甲醇至刻度，静置0.5 h，滴加无水甲醇至刻度，摇匀，经过0.45 μm微孔滤膜过滤，取滤液，备用。

1.3.4 色谱条件 色谱柱为Phenomenex C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；无水甲醇-水（70∶30，V/V）作流动相，并有无水乙醇（纯度≥99.7%）夹带剂；柱温为30 ℃；流速为0.5 mL/min；检测波长为254 nm。进样量为20 μL，平均室温为19 ℃，平均湿度为47%[9-11]。

1.3.5 线性范围考察 分别精密吸取标准溶液1.00、1.25、1.67、2.50、3.41 mL至50 mL容量瓶中，补加甲醇稀释至刻度线，分别标号为1号到5号，摇匀，静置0.5 h，定容。置于高效液相色谱仪，精密吸取20 μL，按前述色谱条件分别进样，测定各峰面积。以峰面积为横坐标，样品浓度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

1.3.6 回收率及精密度试验 精密称取钩藤提取物细粉0.100 g，分别加入高、中、低浓度的对照品溶液，其他步骤同样品处理方法，测定加样回收率。取3种不同浓度的钩藤碱溶液，各浓度重复测定5次，计算其浓度和精密度（RSD）。

1.3.7 样品测定 取钩藤提取物样品溶液20 μL，按前述色谱条件进样，测定含量。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察结果

以峰面积为横坐标，以钩藤碱标准溶液的浓度为纵坐标，进行回归分析，得到回归方程为y=7.000 0×10-8x-0.000 6（R2=0.994），当浓度在0.015～0.022 mol/mL内呈良好的线性关系，见图1。

2.2 回收率、精密度试验结果

结果表明，方法的平均回收率为97.35%，RSD为1.83%，符合测定基本要求。表明该方法简单、准确、快速，可用于该实验中钩藤碱含量的测定[12，13]。

2.3 样品含量测定

钩藤碱标准溶液及样品HPLC色谱图分别如图1、图2所示。测得钩藤提取物中钩藤碱含量为12.68%。

3 小结与讨论

（1）本研究与同类中药超临界萃取最佳萃取条件相比[14，15]，钩藤碱在超临界状态下萃取率相对较低，但仍能得到一定的产量。而且SFE法萃取钩藤碱体现了简单、快速的优势。

（2）HPLC法测定钩藤碱回归方程表明，钩藤碱在0.015～0.022 mol/mL内呈良好的线性关系。此法可用于钩藤提取物中钩藤碱的含量分析，为钩藤碱的分离、鉴定提供依据。在后续的研究中，结合质谱分析技术，对产物的组成将有更深入的了解。

（3）钩藤碱的含量测定方法有高效液相色谱法、薄层扫描法，国家标准采用了薄层扫描法测定其含量，但结果证明，薄层扫描法重复性较差，不宜采用[11]。吴卫等[13]采用了C18柱高效液相色谱法测定钩藤碱的含量，结果表明该法准确。本研究采用C8柱，柱效更佳，试验条件可以对超临界提取物的分析中推广。

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