枸杞子极性成分HPLC指纹图谱的研究

邓洁雄 卢讯聪 颜惠芳

（1广东省广州市药品检验所四分所，广州510405；2广东省汉古中医药创新研究院，广州510000）

枸杞子极性成分HPLC指纹图谱的研究

邓洁雄1卢讯聪1颜惠芳2

（1广东省广州市药品检验所四分所，广州510405；2广东省汉古中医药创新研究院，广州510000）

目的建立枸杞子药材极性成分的高效液相（HPLC）指纹图谱。方法以迪马Kromasil C18为色谱柱，流动相：乙腈-0.8%甲酸，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温25℃，检验波长254 nm，洗脱时间60 min。结果建立了枸杞药材极性成分的HPLC指纹图谱共有模式，标定了13个共有峰，宁夏5个产地相似度在0.97以上，其他产地枸杞药材相似度较差，河北青龙相似度仅有0.305。结论建立的枸杞指纹图谱可为枸杞质量控制及道地性研究提供一定的参考依据，宁夏中宁作为枸杞道地产区有一定科学性。

枸杞；高效液相色谱；指纹图谱；极性成分

枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》，列为上品。具有滋补肝肾，益精明目的作用，可用于虚劳精亏，腰膝酸痛，眩晕耳鸣，内热消渴，血虚萎黄，目昏不明等症状［1］。研究表明，枸杞主要活性成分为多糖、黄酮类和生物碱等［2］，其中大部分为极性成分。中药化学成分复杂，单对某个化学成分进行含量测定难以确保其科学性，中药指纹图谱可进行多指标、客观、综合的评价，能更全面反映中药成分的全貌，是目前确保中药质量稳定、可控的一种有效手段，是中药标准化的内容之一。目前，有学者建立枸杞黄酮类化合物、多糖［3-4］的高效液相（HPLC）指纹图谱，枸杞极性化合物为其有效部位，其HPLC指纹图谱未见报道。本研究采用HPLC建立枸杞子极性部位指纹图谱，旨在为其建立一套科学可行的质量控制与评价方法，保证枸杞子有效性和道地性。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent-1100高效液相色谱仪（DAD检测器，自动进样器，在线脱气，四元泵）（美国安捷伦公司）；KQ-300VDB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；A4DL型自动纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；BS210S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试药芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号0720-9807）；10批枸杞子药材分别采集于宁夏、新疆、甘肃、内蒙古、河北等地（见表1），经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实；乙腈为色谱纯（美国Burdick＆Jackson公司），甲酸等其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

表1 10批枸杞子药材来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：迪马Kromasil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相A：0.8%甲酸，流动相B：乙腈，梯度洗脱条件：0～30 min（7%～18%B），30～50 min（18%～28%B），50～60 min（28%～50%B）；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检验波长：254 nm。

2.2 对照品的制备精密称取芦丁对照品适量，置入25mL量瓶，甲醇液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.052 mg/mL芦丁对照品溶液。

2.3 供试品的制备取本品粗粉约5 g，精密称定，置入500 mL锥形瓶，加95%乙醇200 mL，冷浸处理12 h，滤出冷浸液，药渣按照上述步骤重复操作2次，合并冷浸液，于50℃减压旋蒸蒸干，残渣用50 mL水溶解，石油醚（60～90℃）萃取3次，每次50 mL，弃去醚层，水层用正丁醇萃取3次，每次50 mL，合并正丁醇层，水浴80℃蒸干，残渣加水25 mL溶解，抽滤，滤液上聚酰胺柱。150 mL水洗脱，弃去洗脱液，再用125 mL 30%乙醇洗脱，收集洗脱液，水浴80℃挥干，残渣加适量30%乙醇溶解，转移至2 mL量瓶，用30%乙醇定容至刻度，摇匀后过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液即得。

2.4 测定方法精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1项色谱条件记录60 min色谱图。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察精密吸取同一供试品溶液，按2.1项色谱条件重复进样5次。13个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.85%，相对峰面积的RSD均小于2.6%，符合指纹图谱技术要求。

2.5.2 稳定性考察分别取同一供试品溶液，按2.3项方法提取，采用上述HPLC条件，分别于0，4，8，16，24 h进样测定。13个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.78%，相对峰面积的RSD均小于2.48%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.3 重现性考察取同一批枸杞子药材样品5份，按2.3项供试品溶液制备方法操作，依2.1项条件分别进样。13个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.85%，相对峰面积的RSD均小于2.6%，符合指纹图谱技术规定。

2.6 枸杞指纹图谱的建立

2.6.1 共有峰建立及标定经对照品的HPLC图谱定位，8号峰为芦丁峰。实验选择8号峰（芦丁）为参照峰，其相对保留时间和峰面积为1，计算各共有指纹图谱的相对保留时间及峰面积比值（见表2、表3）。10批枸杞标定了13个共有峰，占总峰面积的83.6%，各共有峰的相对保留时间RSD均小于2.12%，重现性好，而各共有峰的相对峰面积值差别较大，可用于鉴别和区分不同来源的枸杞子药材。

2.6.2 指纹图谱相似度评价采用中药色谱指纹图谱相似度软件（2004A版），处理10批不同产地供试品HPLC图谱，生成对照指纹图谱，以此为参照计算出10批药材相似度；同时以道地产区宁夏中宁枸杞（S1）为参照，计算其他9批药材相似度（见表4）。结果表明，以宁夏中宁枸杞（S1）为参照，宁夏5个产地的枸杞相似度较好，其他5个产地相似度较差，河北青龙产枸杞子药材相似度仅有0.305。

表2 不同产地枸杞子指纹图谱共有峰相对保留时间

表3 不同产地枸杞子指纹图谱共有峰相对峰面积

表4 10批枸杞子样品HPLC指纹图谱相似度评价

图1 枸杞子HPLC指纹图谱

3 讨论

枸杞子中的极性成分主要为黄酮类，根据其化学特性，考察甲醇、95%乙醇、水和正丁醇4种溶剂提取效果，以95%乙醇提取物的出峰数最多，根据实验目的，采用石油醚脱脂和聚酰胺洗脱等方法纯化枸杞极性成分。同时实验比较了超声提取法、回流提取法和冷浸法提取效果，以冷浸法效果较佳。

实验对流动相进行考察，比较了乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.5%甲酸3种流动相，其中以乙腈-0.5%甲酸为流动相，色谱峰峰形对称，分离度高，但峰展宽较大。经过进一步优化，在乙腈-0.8%甲酸条件下，峰展宽明显变小。实验采用二极管阵列检测器（DAD）于200～600 nm范围扫描，样品液在254 nm处有最大吸收。同时实验对色谱柱、梯度洗脱条件、流速、柱温等条件进行了考察，优选出最佳的色谱条件。

自古以来，宁夏中宁枸杞因色艳、粒大、皮薄、肉厚、籽少、甘甜而被奉为道地药材，但近年新疆、河北、内蒙等地枸杞种植面积增大，产量明显增多，其品质是否与宁夏枸杞一致，有必要进行科学考证。本实验采用HPLC建立不同产区枸杞的指纹图谱，建立枸杞特征指纹图谱峰，评价其相似度，鉴别枸杞内在质量，阐述枸杞不同产地的区别。实验结果表明，不同产地枸杞化学成分及含量有一定差异，而宁夏5个产地枸杞子在HPLC图谱的峰数、大小基本一致，相似度较好，说明宁夏中宁作为枸杞道地产区有一定科学性。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:232.

［2］江旭锋.枸杞子化学成分及其药理学研究概况［J］.江西中医学院学报，2013，25（3）:98-100.

［3］张自萍，廖国玲，李弘武.宁夏枸杞黄酮类化合物HPLC指纹图谱研究［J］.中草药，2008，29（1）:103-105.

［4］蒋梅，谭丽蓉，黄晓洁.枸杞子多糖柱前衍生HPLC指纹图谱分析［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（22）:53-56.

Research on Polar Components of Lycium Barbarum L.by HPLC Fingerprint

DENGJiexiong1，LU Xunchong1，YANHuifang2
（1.Thefourthbranchof GuangzhouInstituteforDrugControl，Guangzhou510405，China；2.HAN-GU TraditionalChineseMedicineInnovationResearchInstitute，Guangzhou510000，China）

Objective To establish a method for HPLC-fingerprint of polar components of Lycium barbarum L.Methods Using the methods of HPLC to establish the fingerprint for R．aconiti from different areas，Dikma Kromasil C18 column was used at 25℃，acetonitrile-0.8%formic acid as mobile phase，gradient eluting，flow rate was 1.0 mL/min，detection wavelength was set at 254 nm and eluting period was 60 min.Results HPLC-fingerprint of Lycium barbarum L.in different areas was established，which contained 13 common peaks，and the similarity were over 97%in five batches of herbal medicine from Ningxia，there are some differences in the of other origin，Hebei Dragon similarity is only 0.305.Conclusion Established fingerprint could be used for quality control and reference genuineness for the genuineness of Lycium barbarum L.，there was a certain scientific for genuineness area in Zhongning.

Lycium barbarum L.；HPLC；chromatographic fingerprint；polar components

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.15.072

1672-2779（2015）-15-0142-03

：杨杰本文校对：杨杰

2015-06-25）