银合欢组织培养研究初报

苏慕乔　周爽　白昌军　唐军　吴繁花　蔡秀清　刘进平

摘要：以银合欢（Leucaena leucocephIa（Lamarck）de wit）无菌实生苗子叶和胚轴切段为外植体，以MS为基本培养基，研究不同BA和NAA浓度组合对银合欢组织培养效果的影响。结果表明：愈伤组织诱导培养中，以子叶的培养反应性最好，其愈伤组织诱导率在各种组合中都达到100%，其中以附加0.1mg/LNAA和2.5-7.0mg/LBA效果最好；胚轴在添加0.1mg/LNAA及3.0-4.5mg/LBA的MS培养基上培养时愈伤组织诱导率较高。子叶愈伤组织在MS+3.0mg/L BA+0.2mg/LNAA的培养基中培养时芽分化率只有6.7%；胚轴愈伤组织则未能实现芽的分化。

关键词：银合欢；无菌萌发；组织培养；愈伤组织

中图分类号：Q813.12

银合欢（Leucaena leucocephla（Lamarck）de Wit）为豆科（Leguminosae）含羞草亚科（Mimosoideae）银合欢属（Leucaena Bentham）多年生灌木或乔木，别名白相思子、细叶番婆树、臭菁仔，原产于美洲，现广泛分布于世界热带亚热带地区。银合欢生长快，适应性强（适应温带、亚热带乃至热带气温），对土壤无苛求，耐干旱瘠薄，根系发达，在近地表层的根系上着生许多根瘤，可固定空气中总的游离氮，对绿化荒山、保持水土、提高土壤肥力有重要作用。因此，银合欢可作为荒山绿化的先锋树种，是优秀的水土保持植物。此外，银合欢萌生力强，速生高产，其树干材质优良，可作木材、胶合板、造纸原料：又是能源树种，可作薪材。更重要的是，银合欢鲜嫩茎叶年产量达37-60t/hm²，叶片干物质中粗蛋白质含量达22%-29%，含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质、氨基酸、胡萝卜素、多种维生素和微量元素，适口性好，是理想的蛋白饲料，被誉为“奇迹树”，还被联合国粮农组织的饲料专家誉为干旱地区的“蛋白质仓库”，但种子、枝叶均含有毒的含羞草素，若利用不当则会对畜禽有害。银合欢是联合国粮农组织向亚太地区推广的多用途优良树种之一。

对银合欢进行组织培养研究，除有望对银合欢进行大规模快速繁殖和人工种子研制外，还可在植物组织培养的基础上，对银合欢进行生物技术育种，尤其是银合欢种子、叶片和根系等器官中含有含羞草素，对非反刍动物和瘤胃无降解银合欢能力的反刍动物均有毒，如果能利用基因工程技术减少甚至完全抑制毒素的产生，其作为饲料的利用价值将会更大。前人的研究中曾有关于银合欢芽或带芽茎段组织培养的报道，但目前尚未见关于银合欢其他外植体组织培养的报道。本研究以银合欢无菌实生苗子叶和胚轴为材料进行组织培养的初步研究。

1.材料与方法

1.1材料

银合欢种子由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。

1.2方法

1.2.1种子的无菌萌发

由于银合欢种皮坚硬，不易萌发，因此将种子置于不同温度的水中进行预处理，以促进种子萌发。经预处理后用纱布将种子包裹起来进行消毒，先用75%酒精表面消毒1min，再用0.1%升汞灭菌15min，随后用无菌水洗4-5次：在超净工作台上将种子接种于不含任何生长调节物质的MS培养基（附加30g/L蔗糖和0.7%琼脂），每瓶接3-4颗种子：萌发培养1周后取下子叶和下胚轴，以其为外植体进行组织培养。

1.2.2子叶和胚轴培养

将无菌萌发的银合欢实生苗子叶切成约5mm²大小，胚轴切成0.5cm左右的片段，分别接种于附加不同浓度BA和NAA的MS培养基上进行愈伤组织诱导培养。每个组合接种60个以上的外植体，1个月后进行观察统计。之后进行愈伤组织分化培养，分化培养基中添加不同浓度组合的BA和NAA，以此进行配比试验。每个组合接种60个以上的愈伤组织，所有的培养基都附加30g/L蔗糖和0.7%琼脂。

1.2.3培养基准备和培养条件

培养基在灭菌前将pH调为5.8，经121℃高温高压灭菌20min，待其冷却后用于接种。在变温条件下培养，昼夜温度分别为25、18℃，白天用日光灯补充光照12h，光强为2000-300lx。

2.结果与分析

2.1不同温度的水处理对银合欢种子无菌萌发的影响

不同处理方法对银合欢种子无菌萌发的影响见表1。在不同温度的水处理中，温度越高，萌发率越低，沸水煮8min甚至没有一粒种子萌发。其中，以60℃温水泡8min时发芽率最高，可达55.0%：而用冷水浸泡10min时发芽率仅为20.0%。经处理后的种子表面消毒比较彻底，污染率基本为0。

2.2不同BA和NAA浓度配比对银合欢子叶和胚轴愈伤组织诱导的影响

在预备试验中，单独附加NAA的培养基上，银合欢子叶和胚轴愈伤组织诱导率极低，因此以不同浓度的BA与低浓度的NAA配比进行试验。在所有配比试验中，子叶的培养反应性最好，其愈伤组织诱导率在各种组合中都达到100%（表2）。接种6-7d内，子叶切段切口处发生不同程度的肿胀，8-15d内陆续出现乳白色的愈伤组织，随着培养时间的延长，逐渐转变为黄色、致密的愈伤组织。前5种配比试验中，以2.5mg/LBA+0.1mg/LNAA培养效果最好，其愈伤组织长势好、体积大。之后以0.1 mg/LNAA搭配不同浓度的BA进行试验。结果表明，2.5-7.0mg/LBA与低浓度NAA配合使用，对银合欢子叶愈伤组织诱导有良好的促进作用（图1）。

与子叶类似，前5种配比试验中，胚轴在MS+2.5mg/L BA+0.1mg/LNAA中培养效果较好，愈伤组织生长较旺盛，长出的愈伤组织呈淡绿色、松散、柱状、体积较大；而其他4种培养基中的愈伤组织呈白色、透明、表面干燥松软、体积不大。在以0.1mg/LNAA搭配不同浓度BA的试验中，BA在3.0-4.5mg/L之间时愈伤组织诱导率较高，长势较好，当BA低于2.5mg/L或高于5.0mg/L时愈伤组织诱导率都偏低，且胚轴易褐变，死亡率高。Ms+4.0mg/LBA+0.1mg/LNAP，培养基中愈伤组织诱导率最高（表2）。试验中未见有直接不定芽发生。

2.3不同BA和NAP，浓度配比基对银合欢子叶和胚轴愈伤组织分化的影响

不同BA和NAA浓度配比对银合欢子叶和胚轴愈伤组织分化的影响见表3。子叶愈伤组织在以0.1mg/LNAA搭配不同浓度BA的试验中，BA浓度为3.0mg/L时未见任何分化，而BA浓度在5.0和6.0mg/L时，分别有1.8%和3.3%的根分化，而未见芽分化：在0.2mg/LNAA搭配不同浓度BA的试验中，BA浓度为3.0mg/L时有6.7%的芽分化，而其他各组未见任何分化。胚轴愈伤组织在不同配比的分化培养基中都未出现任何分化情况，反而继续脱分化产生愈伤组织，且比原先的愈伤组织更有水分，更紧实，颜色更深，生活力更强。

3.讨论

从野外采集的银合欢外植体不易进行表面消毒，而以无菌实生苗作为外植体则易于操作。银合欢种皮坚硬，不易萌发，60℃的温水浸泡8min后无菌萌发效果较好。

豆科植物一般较难进行组织培养，但近年来在大豆、蚕豆、苜蓿、苦豆子及花生等豆科组织培养方面取得了较大的进展，一般以茎尖、真叶、子叶、胚轴、合子胚等为外植体获得再生植株。本科植物可能对植物激素有特殊要求，一般要降低生长素浓度或提高细胞分裂素浓度。有报道称同科的苜蓿下胚轴愈伤组织诱导和再生都好于子叶，2，4-D诱导愈伤组织的效果优于NAA。许智宏等报道称赤豆上胚轴切段在单加细胞分裂素的培养基上培养2周后即可形成芽，在附加低浓度BA（1mg/L）的培养基中，再加入2mg/LIAA或0.2mg/LNAA明显提高芽形成的百分率，但高浓度的NAA则促进愈伤组织的形成。本研究利用2组BA+NAA组合，即2.5mg/LBA+0-0.4mg/LNAA和1.5-7.0mg/LBA+0.1mg/LNAA，均未能诱导银合欢子叶和胚轴直接成芽，但可诱导其形成愈伤组织。而在预备试验中，单独附加0.1mg/LNAA时只有28%的子叶被诱导形成愈伤组织，而添加0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA时有极低频率（2.7%）的不定芽形成。在子叶愈伤组织分化培养中，只有3.0mg/LBA+0.2mg/LNAA组合使芽分化率达6.7%，而胚轴的愈伤组织培养不仅诱导率很低，而且有较多的褐化发生，在分化培养基中也未见芽分化。这种不同外植体对生长调节物质反应性的不同可能与基因型有关，同时也说明还需要更多的细胞分裂素和生长素类型及其浓度组合试验才能获得较好的培养结果。在分化培养中，高浓度的BA也能促使不定根的分化，这在别的植物中极少出现。这种先生根的愈伤组织基本上没有再培养的价值，因为这样的愈伤组织无法再诱导出芽，即使成芽，其维管组织也不会与根的维管组织相连。