CP/MAS 13C NMR光谱法分析烟草纤维素的结构

冯广林，谭兰兰，朱晓兰，高芸，戴亚

1 川渝中烟工业有限责任公司技术研发中心, 成都 610017;2 中国科学技术大学烟草与健康研究中心，合肥 230052

烟草与烟气化学

CP/MAS13C NMR光谱法分析烟草纤维素的结构

冯广林1，谭兰兰1，朱晓兰2，高芸2，戴亚1

1 川渝中烟工业有限责任公司技术研发中心, 成都 610017;2 中国科学技术大学烟草与健康研究中心，合肥 230052

采用交叉极化/魔角旋转 (CP/MAS)13C NMR光谱法结合光谱拟合技术对酸性洗涤剂洗脱的烟草纤维素样品进行了晶体结构分析，光谱峰的拟合结果显示烟草纤维素晶型以Iβ为主要晶体形式，烟草纤维素的结晶度在50%左右。烟草纤维素基原纤尺寸在3.0-5.0 nm之间，基原纤聚集束的尺寸在6-13 nm。此项研究可以为纤维素改性、烟草加工以及低次烟叶和烟梗的处理等方面提供重要的理论依据。

烟草；纤维素； CP/MAS；NMR光谱；结晶结构

纤维素作为构成烟叶细胞组织和骨架的基本物质，在烟叶中含量一般在11%左右，并随着烟叶等级的下降而增加。纤维素可以提高烟叶燃烧性，使烟叶持火力增强，但纤维素含量过高时，烟叶组织粗糙而容易破碎[1]。在低次烟叶中，还原糖和可溶性总糖含量很低，纤维素、半纤维素含量较高，致使低次烟叶具有强烈的刺激味、青杂气重、吸味辛辣、涩口，在烟叶燃吸时会引起刺激性的呛咳。因此，烟草配方中高纤维素含量，会对燃吸品质产生副作用，赋予烟气一种尖刺的刺激性和一种“烧纸”的气味，使烟叶的香气不能显露，影响烟叶的感官质量[2]。在烟草的加工过程中，纤维素大分子晶型结构及原纤尺寸的变化等因素对于烟草的润胀吸湿性能和柔韧性等品质都有重要的影响[3]。因此，纤维素含量及其微观结构对于烟叶的品质和利用有很重要的意义。

对于纤维素的分析测定工作大致可以分为三个阶段：粗纤维法、纤维洗涤剂法和酶法[4]。目前的行业标准方法[5]是采用中性洗涤剂、酸性洗涤剂以及72%硫酸分别依次除去烟草中的非细胞壁物质，并经过滤、洗涤、干燥、灰化、称重、计算等步骤分别得到中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸洗木质素的含量，进而换算得到纤维素的含量。该方法虽然具有选择性好、灵敏度高的特点，但操作比较繁琐，操作周期长、工作量大，更为重要的是对烟草中此类构架类物质的结构和组成没有涉及，对纤维素的晶型组成及比例的研究也基本空白[6]。

交叉极化结合魔角旋转13C核磁共振法（CP/MAS13C NMR）技术由于能够直接采用固体粉末定量地估计其化学组成和化学结构，对其组分不必进行分离和溶解等处理就可以直接测定而获得可靠的结构信息，已经成为研究高分子化合物化学结构和物理性质最重要的工具之一[7-9]。本论文采用CP/MAS13C NMR法结合光谱拟合技术研究烟草纤维素晶体的晶型分布及比例、纤维素的结晶度、原纤聚集态尺寸等结构信息，对于进一步研究其对烟草加工和润胀性能的影响，改善烟叶的吸食质量，提高低次烟叶和烟梗的使用价值具有重要应用价值和现实意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

正辛醇（C8H18O，消泡剂）、十六烷基三甲胺溴（C19H42BrN）、98%浓硫酸（质量分数）、石英砂、乙醇、丙酮、苯（AR，上海化学试剂四厂）。纤维素标样（纯度＞98%，上海百灵威化学品公司）。水为二次双蒸水。

酸性洗涤剂（2%十六烷基三甲胺溴）:用50 mL量筒量取约27.2 mL 98%浓硫酸，缓慢加入已装有500 mL蒸馏水的烧杯中，冷却后转移至1000 mL容量瓶，使用水定容至刻度，配置成1.0 mol/L硫酸溶液；称取约20 g十六烷基三甲胺溴于1000 mL烧杯中，加入配置好的1.0 mol/L硫酸溶液，搅拌溶解，转移至1000 mL容量瓶，定容至刻度。

烟叶样品取自川渝中烟工业公司，包括云南烤烟、湖南香料烟、湖北白肋烟和广州晒黄烟4个不同类型及贵州毕节上、中、下3个部位不同等级（B2F、C3F和X2F）烤烟烟叶，烟样于40 ℃烘箱中干燥4 h后，粉碎，过150 μm（100目）筛，备用。

小型设备有HHS11-2型恒温水浴锅；D2010W型电动搅拌器；SL234型电子天平（感量：0.0001 g，美国Denver公司）；PHS3C型精密pH计；FZ102型植物粉碎机；TNX1600-30马弗炉、BridgeLux纤维分析仪（配置石英过滤坩埚）。

1.2 烟草纤维素的提取和分离[5]

取两份烟样，按照行业标准（YC/T 347—2010）进行相同的前处理，即采用上述1.3的酸性洗涤剂溶剂和72%硫酸溶液洗脱烟草有机溶剂溶解物如糖、淀粉、蛋白质、果胶及半纤维素等得到纤维素，一份进一步灰化计算出含量（纤维素含量为9.84%，木质素2.87%），另一份作为烟草纤维素参比样品，进行CP/MAS13C NMR分析。此样品的光谱图扣除根据灰化测定的纤维素含量的制备的纤维素标准样品光谱吸收，得到烟草样品的非纤维素背景光谱吸收。待测烟样同样采用行标方法洗脱后，其CP/MAS13C NMR光谱扣除非纤维素背景光谱吸收即可得到待测样品的纤维素光谱图。

1.3 仪器及测试方法

1.3.1 烟草纤维素的CP/MAS 13C NMR光谱分析

CP/MAS13C NMR光谱利用AVANCE AV 400 spectrometer超导傅立叶数字化核磁共振谱仪（瑞士Bruker)记录，测试条件：场强9.40 T，4 mm和7 mm魔角探头，转速15 kHz，脉冲宽度90°，交叉极化时间4 µs，接触时间2 ms，采样时间34 ms，采样间隔时间2.0 s，扫描次数：1024，谱宽300 ppm,一级定标用四甲基硅烷(CH3)4Si。13C CP/MAS NMR光谱化学位移、光谱峰面积及在δ 60-110 ppm的分解峰形拟合的计算是采用MestReNova 6.1.1核磁软件进行分析，峰形分解的结果用来计算纤维素的晶型分布及比例、纤维素的结晶度、原纤聚集态尺寸等结构信息。

1.3.2 烟草纤维素的XRD光谱分析

XRD分析在日本玛珂公司TTR-Ⅲ型大功率X射线粉末衍射仪上进行测定，纤维素样品安放在玻璃样品架上，在稳定条件下分析。测试条件：Ni滤波，Cu靶Kα射线，管压 40 kV，管流200 mA，扫描速度 2(º)/min，扫描范围从 3 º-50 º。波长：1.541841 A。

1.3.3 烟草纤维素的红外光谱分析

KBr红外光谱分析是将烟草纤维素样品在美国Nicolet MAGNA-IR8700型傅里叶变换红外光谱仪上进行测定，光谱仪分辨率为0.1 cm-1，扫描范围：4000-400 cm-1，扫描次数为50次，扫描速度：0.1 cm/s。

2 结果与讨论

2.1 烟草纤维素分子CP / MAS 13C NMR光谱分析

在对转速、魔角探头、交叉极化时间和弛豫时间等参数进行优化后，最终采用1.3.1所示的实验参数条件，对纤维素标准样品及烟草纤维素样品进行核磁共振波谱分析。图1为纤维素样品CP/MAS13C NMR光谱，样品分别为纤维素标样、酸性洗涤剂洗脱和热蒸馏水洗脱的烟草纤维素样品，光谱吸收所对应的化学位移归属如表1。烟草纤维素的13C NMR吸收信号主要在化学位移δ60-110 ppm处[10]， 95-110 ppm处吸收峰对应的是纤维素的C1区，表征的是晶态结构，通过拟合可以得到纤维素的晶型及其比例，化学位移80-90 ppm C4区对应的是纤维素的结晶区和无定型区两个部分，可以此研究纤维素结晶区内和结晶基原纤表面及无定型区的纤维素分子排列情况，因此拟合结果可以计算结晶度和原纤尺寸。化学位移63 ppm 和68-76 ppm吸收峰分别对应的是C-6和吡喃环上其他C(C-2,3,5)。另外，还有一些弱的杂质吸收峰，如53 ppm处的甲氧基吸收和30 ppm处的脂肪碳吸收。如图1所示，两种烟草纤维素样品中，蒸馏水洗脱样品的光谱因为含有果胶、半纤维素等杂质，谱图干扰多，所得纤维素样品纯度不高。酸性洗涤剂洗脱样品光谱图上C-1吸收峰峰的位置稳定、峰形对称性较好（有少量木质素杂质），在背景扣除（消除干扰）后其峰面积与纤维素的存在量呈良好的线性关系，可实现烟草样品中纤维素固体的直接光谱分析[11]。

图1 烟草提取纤维素样品的13C CP/MAS NMR光谱图Fig.1 13C CP/MAS NMR spectra of cellulose samples extracted from tobacco

表1 纤维素分子CP/MAS 13C NMR光谱的化学位移归属Tab.1 CP/MAS 13C NMR chemical shifts (in ppm) for cellulose

2.2 烟草纤维素样品干扰的扣除

如图1示，按照行业标准方法（酸性洗涤剂法）得到烟草纤维素样品由于仍然含有木质素等杂质，其13C NMR波谱与纤维素标样相比在化学位移105ppm纤维素C-1吸收峰处有少量干扰，因此需扣除木质素等干扰吸收峰。如图2所示，选择烟草纤维素参比样品（图2b）扣除相同含量（按照行业标准方法洗涤灰化后测得纤维素含量）的纤维素标准样品（图2a）的光谱吸收后作为非纤维素背景吸收（如图2c所示），选择参比样品的原则是要使非纤维素背景吸收中化学位移105ppm和88ppm处（分别对应C-1 和C-4吸收峰）强度最低但不能出现负峰[11]。最后再将烟草纤维素待测样13C NMR图（图2d）扣除非纤维素背景吸收，得到样品中仅纤维素吸收的光谱图（图2e），再进行后续的结构分析（包括晶型比例、结晶度及原纤尺寸等）。

图2 烟草酸性洗涤剂提取纤维素样品及背景吸收的13C CP/MAS NMR光谱图Fig.2 CP/MAS 13C NMR spectra of tobacco cellulose samples and backgroud

2.3 烟草纤维素的晶型与含量

天然纤维素（包括烟草纤维素）是以纤维素I形式存在的，是纤维素Iα和纤维素Iβ两种晶体的混合物[12]。纤维素Iα和Iβ分别指的是1个链的三斜单元晶胞和2个链的单斜单元晶胞，在一定条件下它们可以相互转化[13]。次晶表示的是有序性不及但运动性大于纤维素Iα和Iβ的结晶结构[3,14]，其含量变化可以用来反映晶体结构的变化。

根据Wickholm等的研究结果[12]，在CP/MAS13C NMR光谱图上，对烟草纤维素C1信号峰拟合，采用4个Lorentzian线形表示不同晶型，分别为结晶区纤维素Iα（δ105.1ppm）、纤维素Iβ（δ105.7和δ104.0ppm的双峰）以及次晶纤维素（δ104.6ppm），根据拟合分峰的面积计算出纤维素Iα和Iβ以及次晶的的相对含量（如图3和表2示）。

图3 烟草纤维素样品的C1区光谱拟合的结果Fig.3 Fitting of C-1 spectral region of 13C CP/MAS NMR spectra of cellulose in tobacco

表2 由13C CP/MAS NMR C1区光谱计算出烟草纤维素样品（贵州中部烤烟）的晶型含量Tab.2 Contents of crystalline allomorphs obtained from 13C CP/MAS NMR spectra of cellulose in tobacco ( fl ue-cured tobacco from middle area of Guizhou province)

表2显示了烟草纤维素中各晶型的相对含量，计算得出其Iα和Iβ两种晶型相对含量的比值为0.425。晶型的组成与植物的种类关系密切，不同来源的纤维素Iα和Iβ晶型含量比值不同。桉木浆纤维、苎麻、棉纤维和竹浆中Iα和Iβ两种晶型相对含量的比值分别为 0.51，0.47，0.26 和 0.25[15]。

实验进一步分析了国产烤烟烟叶和烟梗、贵州烤烟不同部位及国产不同类型的烟叶纤维素样品的晶型含量和分布，结果如表3中所示，所有的样品均显示烟草纤维素以Iβ晶型为主，烟梗的纤维素晶型含量和分布与上部烟叶类似。

表3 由13C CP/MAS NMR光谱计算的不同烟草纤维素样品的晶型含量结果Tab.3 Contents of crystalline allomorphs obtained from 13C CP/MAS NMR spectra of cellulose in tobacco samples

2.4 烟草纤维素的结晶度

纤维的结构既不是完全晶态，也不是完全无定型态的，是部分结晶和部分取向，聚集态结构中的结晶部分及无定型部分都是决定纤维素性质的重要方面[16]。纤维素的化学位移80-90 ppm处的C4谱线裂分为两部分（如图4）：窄的低场和宽的高场，分别对应着纤维素的结晶区和非结晶区，在结晶区的化学位移为δ86-92ppm，在非结晶区为δ80-86ppm，可据此处信号峰的面积按表4中公式来计算纤维素的结晶度[15]。

表4中列出了采用三种不同方法来计算烟草纤维素样品的结晶度，从结果来看，烟草纤维素样品的结晶度在50%左右，用13C NMR方法得到的结晶度要比X射线衍射法（XRD法）的计算结果略低些，这是由于相比XRD，13C NMR对小范围的有序更为敏感，在13C NMR中，结晶区信号峰的强度取决于每个相内部的C原子数目，即只有晶区内的部分才能被看作是结晶区，因而结晶度的大小取决于晶粒尺寸以及结晶的完整性，而提取过程会使纤维结晶体的完整性受到破坏，晶粒的表面积增加。因此，对于结晶区有缺陷的纤维素来说，13C NMR可能更能准确地分析纤维素大分子排列的有序情况[15]。至于红外光谱法（IR法）测定的结果更高，可能存在少量的木质素干扰，使得结果不够准确。

不同部位的贵州烤烟样品结晶度结果显示下部烟的纤维素结晶度最高，中部烟次之，上部最低。从不同类型烟叶结晶度结果来看，晒黄烟的结晶度最高（54.6%），湖北白肋烟的结晶度最低（46.3%），烤烟与香料烟差距不大。

图4 烟草纤维素样品（贵州B2F）的光谱分布Fig.4 CP/MAS 13C NMR spectra of cellulose in tobacco (Guizhou B2F).

表4 由CP/MAS 13C NMR光谱计算出不同烟草纤维素样品的结晶度Tab.4 Degrees of crystalline obtained from CP/MAS 13C NMR spectra of cellulose in tobacco samples

2.5 烟草纤维素原纤结构的研究

植物纤维细胞壁中纤维素分子链平行排列形成基原纤，再由若干根基原纤组成微原纤，微原纤平行的组合在一起形成原纤。微原纤是纤维的主要结构单元，晶区位于微原纤内，称为“微晶”或“胶束”。基原纤即丝状多晶体，是结晶纤维素中最小的结构单元。因此通过计算纤维素晶粒尺寸可得到基原纤的横向尺寸。研究发现，纤维素不同组织水平和结构水平上的变化(纤维、原纤、微原纤、基原纤及纤维素链等发生结构的变化)会影响纤维素在化学改性中的活性、纤维素被酶水解的易感性和纤维的强度性能等[18]。

以图4为基础，利用CP/MAS13C NMR光谱，在有序的C4区域（δ 86～92），用于模拟模型的包括来自结晶纤维素I的三种信号的Lorentzian谱线：纤维素 Iα(δ 89.6)、纤维素 Iα+β(δ 88.8)和纤维素Iβ(δ 88.0)；在无序的区域(δ 80～86)是由非晶态纤维素引起的四种信号的Gaussian谱线：次晶纤维素(δ 88.5)、可及基原纤表面(δ 83.4与 δ 84.3)和不可及基原纤表面(δ 84.0)，利用混合Lorentzian和Gaussian函数模型（如图5）拟合技术就能准确分析纤维素不同结晶结构所占比例[13]，再根据经验公式q= ( 4n-4 ) / n2，计算横向基原纤尺寸及基原纤聚集束尺寸[15]（结果见表5）。

图5 纤维素分子的CP/MAS 13C NMR光谱信号峰C4区的拟合结果Fig.5 Spectral fi tting of the C4 regions in CP/MAS 13C NMR spectrum

表5列出了几种烟草纤维素样品的CP/MAS13C NMR光谱C4区拟合得到的结晶和非晶区的比例及基原纤结构和基原纤聚集束的尺寸。由结晶区几种晶型的拟合结果可进一步计算出结晶度，结果与由面积计算的结果基本一致（如表4示），一方面证实了在微原纤内部次晶纤维素的存在，另一方面也说明拟合结果的可靠性。

根据经验方程计算的基原纤结构和基原纤聚集束的尺寸[15]表明，烟草纤维素的基原纤尺寸在3.0-5.0nm之间，与结晶度之间有明显的相关性，基原纤聚集束的尺寸一般小于13nm。这些方法和数据可以用来进一步研究烟草加工和改性过程中纤维素晶体内部结构的变化及其对品质（如润胀性能等）的影响，从而为烟草纤维素的改性提供理论依据。一般来说，在纤维素酸解过程中，由于半纤维素和木质素的脱除，可及基原纤表面增加，基原纤聚集束的尺寸会有所下降[19]。

表5 不同烟草纤维素样品C4区光谱拟合的定量信息Tab.5 Quanti fi cation results from spectral fi tting of tobacco cellulose C4-region

续表5

3 结论

烟草纤维素晶型以Iβ晶型为主要晶体形式，烟草纤维素的结晶度在50%左右。烟草纤维素基原纤尺寸为3.0-5.0nm，基原纤聚集束的尺寸为6-13nm。本文采用13C NMR技术对烟草纤维素结构进行了初步探索，对于烟叶改性、酶解过程中纤维素结构水平上的变化(结晶度、微原纤、基原纤及纤维素链等发生结构的变化)还有待于进一步深入的研究。此项研究可以为纤维素改性、烟草加工以及低次烟叶和烟梗的处理等方面提供重要的研究基础。

[1]任晓红，陈刚，马海燕，等.烤烟细胞壁物质对烟叶质量影响研究[J].中国农学通报2010,26(4): 113-116.

[2]周顺, 徐迎波, 王程辉, 等.比较研究纤维素、果胶、淀粉的燃烧行为和机理[J].中国烟草学报, 2011, 17(5): 1-9.

[3]Henniges U, Kostic M, Borgards A, et al.Dissolution Behavior of Different Celluloses [J].Biomacromolecules 2011, 12: 870-879.

[4]Bokelman GH, Ryan WS Jr.Aanlyses of Bright and Burley tobacco laminae and stems[J].Beitr.Tabakforsch.Int.1985, 13:29-36.

[5]YC/T 347-2010 烟草及烟草制品 中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸洗木质素的测定 洗涤剂法.

[6]杨斌,殷引,张浩博,等.洗涤剂法测定烟草及烟草制品中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸洗木质素的研究[J].中国烟草学报, 2012, 18(3): 10-15.

[7]Husson E, Buchoux S, Avondo C, et al.Enzymatic hydrolysis of ionic liquid-pretreated celluloses: Contribution of CP-MAS 13C NMR and SEM[J].Bioresource Technology, 2011, 102: 7335-7342.

[8]Holtman KM, Chen N, Chapopell MA, et al.Chemical structure and heterogeneity differences of two lignins from loblolly pine as investigated by advanced solid-state NMR spectroscopy [J].J Agric Food Chem, 2010, 58: 9882-9892.

[9]Mori T, Chikayama E, Tsuboi Y, et al.Exploring the conformational space of amorphous cellulose using NMR chemical shifts [J].Carbohydr Polym, 2013, 93: 122-128.

[10]Zuckerstatter G, Schild G, Wollbold, P, Rode, T, Weber HK, Sixta H (2009).The elucidation of cellulose supramolecular structure by 13C CP-MAS NMR[J].Lenzinger Berichte, 87, 38-46.

[11]Hall RA, Wooten JB.Quantitative Analysis of cellulose in tobacco by CP/MAS 13C NMR [J].J Agric Food Chem, 1998, 46: 1423-1427.

[12]Wickholm K, Larsson PT, Iversen T.Assignment of noncrystalline forms in cellulose by CP/MAS 13C NMR spectroscopy[J].Carbohydr Res,1998, 312: 123-129.

[13]Hult E, Liitia T, Maunu SL, et al.A CP/MAS 13C-NMR study of cellulose structure on the surface of re fi ned kraft pulp fi bers [J].Carbohydr Polym,2002, 49: 231-234.

[14]郑明霞, 李来庆, 郑明月, 等.碱处理对玉米秸秆纤维素结构的影响[J].环境科学与技术, 2012, 35: 27-31.

[15]肖青，万金泉，王艳.CP/MAS 13C NMR技术对木浆纤维微观结构的研究[J].化学学报, 2009, 67: 2629-2634.

[16]万金泉，肖青，王艳.固体核磁共振和原子力显微镜分析不同半纤维素含量植物纤维的微观结构[J].分析化学,2010, 38: 347-351.

[17]马晓娟, 黄六莲, 陈礼辉, 等.纤维素结晶度的测定方法[J].造纸科学与技术, 2012, 31, 75-78.

[18]Rondeau-Mouro C, Bizot H, Bertrand D.Chemometric analyses of the 1H-13C cross-polarization build-up of celluloses NMR spectra: A novel approach for characterizing the cellulose crystallites[J].Carbohydr Polym, 2011, 84, 539-549.

[19]Chunilall V, Bush T, Larsson PT, et al.A CP/MAS 13C NMR study of cellulose fi bril aggregation in eucalyptus dissolving pulps during drying and the correlation between aggregate dimensions and chemical reactivity[J].Holzforschung 2010, 64, 693-698.

Analysis of tobacco cellulose structure by CP / MAS13C NMR spectroscopy

FENG Guanglin1, TAN Lanlan1, ZHU Xiaolan2, GAO Yun2, DAI Ya1
1 Technology Center, China Tobacco Chuanyu Industrial Corporation, Chengdu 610066, China；2 Centre for Tobacco and Health Research, University of Science and Technology of China, Hefei 230052, China

A method utilizing CP / MAS13C NMR spectra was developed for analyzing tobacco cellulose structure.The NMR spectra in combination with spectral fitting were analyzed and structure parameters such as cellulose crystallinity, allomorph composition and lateral dimensions for cellulose elementary fi brils and micro fi brils were determined.Results showed that the main allomorph composition in tobacco cellulose was Iβ.The cellulose crystallinity calculated by spectral fi tting was about 50%.The lateral dimensions for cellulose elementary fi brils and micro fi brils were in the range of 3.0-5.0nm and 6.0-13.0nm, respectively.This study could provide theoretical basis for improving cellulose structure, and stem and leaf tobacco processing.

tobacco; cellulose; CP/MAS; NMR spectroscopy; crystalline structure

冯广林，谭兰兰，朱晓兰,等.CP/MAS13C NMR光谱法分析烟草纤维素的结构[J].中国烟草学报，2015,21（5 ）

川渝中烟工业公司科技基金项目（合同号：JL/CYZY G SJ003-04）

冯广林(1970—)，硕士，高级工程师，主要从事土壤化学及烟草化学研究，Email：fengguanglin1973@yahoo.com.cn

戴亚，教授，Email: dycy@263.net

2014-06-14

:FENG Guanglin, TAN Lanlan, ZHU Xiaolan, et al.Analysis of tobacco cellulose structure by CP / MAS13C NMR spectroscopy[J].Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(5)