光强衰减对烟草叶片碳氮代谢关键基因表达的影响

杨惠娟，王红丽，史宏志*，陈永明

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，河南郑州文化路95号 450002；2 广东烟草南雄科学研究所，广东南雄，512400

生物技术

光强衰减对烟草叶片碳氮代谢关键基因表达的影响

杨惠娟1，王红丽1，史宏志*1，陈永明2

1 河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，河南郑州文化路95号 450002；2 广东烟草南雄科学研究所，广东南雄，512400

通过电子显微镜和反转录PCR方法研究了烟草在遮光处理（分别为100%, 85%, 70% 和 55%的自然光照强度）下烟叶移栽后78天、85天、105天及120天（采收当天）四个时期淀粉的积累和淀粉、糖、氮代谢途径关键基因表达量的变化。结果表明，移栽后105天烟叶生理成熟期之前淀粉含量受光照影响最大，随着光的衰减含量逐渐降低。葡萄糖转化及蔗糖的合成途径中有4个关键基因表达量随光强减少逐渐降低，且随着烟草的成熟也呈下降趋势。淀粉合成酶基因GBSSI在叶片扩展期表达较弱，在叶片成熟期大量表达，随着光照强度的减弱表达量稍有减小。氮代谢途径关键基因Nir、GS等同工酶基因的表达存在一定的互补性，总体基因表达趋势为随光强的减弱表达量逐渐增加，表明在弱光下烟叶氮代谢滞后。

烤烟 ；光强；淀粉；基因表达

植物具有适应光环境急剧变化的能力，叶片是主要感受光的器官，无论是低光、强光和过强光，植物对长、短日照的感受都依赖叶片[1]。植物对光照强度的反应较为复杂，低光主要影响植物的碳代谢，研究报道碳平衡在植物对低光的反应中起重要作用，低光下光合速率和作物产量都显著降低[2]。遮荫可以降低植物中可溶性糖和淀粉的含量，也可以抑制果实的生长和诱导果实酸化[3-5]。光强是决定烟草叶片生长、产量和质量形成的重要决定因子。光照较强的环境生长的烟株鲜重，干重，根体积，干鲜比、根冠比、株高和茎围都大于光照较弱的烟株。随着光照强度的降低，叶片及其表皮、栅栏组织、海绵组织的厚度都呈降低趋势，氮代谢强于碳代谢，叶片叶绿素a和叶绿素b，以及类胡萝卜素的含量也都随之增加[6]。在一定范围内低光处理可以影响烟草基因表达及信号传导[7]。有研究报道在烟草中过表达叶绿素加氧酶基因无论在高光强还是低光强条件下都可以导致淀粉含量增加，干物质积累[8]。在低光低温条件下烟草光系统Ⅱ的活性比高光高温条件下降低更多[9]。光在烟草叶片淀粉合成和积累过程中尤为重要，烟草氮代谢也是受光照影响较大的一个方面，与碳代谢也是相互影响[10]。但目前尚无确切的研究报道烟草叶片在不同光环境下淀粉、糖及氮代谢变化的分子机制。本研究针对光衰减环境对烟草叶片淀粉合成及积累以及相关代谢过程中的关键基因的表达进行了研究，以期探索淀粉、糖及氮代谢途径间的相互联系以及对弱光的响应机制。

1 材料和方法

1.1 材料

试验于2012年在广东烟草南雄科学研究所进行，所用烤烟品种为NX232，采用漂浮育苗，2月23日移栽，行距1.2m，株距0.5m。于烟叶团棵期开始进行遮光处理，遮光所用材料为尼龙网。光照强度使用照度计（ZDS-10F, Shanghai, China）进行测定。光处理分为4组，分别为100%自然光、两层尼龙网遮光处理（光强约为85%）、三层尼龙网遮光处理（光强约为75%）及四层尼龙网遮光处理（光强约为55%）。烟草生长期间两次检测光照强度，每处理分别检测棚内和棚外光照强度，棚内检测3次，取平均值计算每个处理下光照强度（表1）。每个处理面积为36平方米，按照当地常规栽培措施进行施肥、灌水、打顶等大田管理。

1.2 方法

每个处理选取3-5株烤烟中部叶位叶片混合取样，取样时间为移栽后78d ，85 d， 105 d和120d(采收当天)，样品放液氮中保存备用。样品按照电子显微镜和RT-PCR实验要求处理。电子显微镜观察淀粉粒的组织结构变化，各代谢途径关键基因用RT-PCR方法检测。检测基因所用的引物序列见表2。选取Actin基因为内参基因。

表1 遮阴条件下各处理的光照强度Tab.1 Light intensity tests on the environments of four groups

表2 淀粉和糖及氮代谢途径关键基因表达检测所用的引物序列表Tab.2 Primers used for expression examination of genes involved in the sugar, starch, and nitrogen metabolism pathway.

续表2

2 结果和讨论

2.1 光强衰减对烟草叶片淀粉积累的影响

电镜结果显示，移栽后78d烤烟叶片扩展期和85d叶片成熟期样品中淀粉粒含量随光照强度的变化呈逐渐减少的趋势，移栽后85d自然光照下的成熟期叶片淀粉粒体积大，积累早，85%光照环境下淀粉粒则体积变小，数量减少，随着光强降低至70%和55%，淀粉粒显著减少，直至最弱光下几乎无积累。移栽后105d生理成熟期各光照处理间淀粉粒数量差距逐渐缩小，但淀粉粒体积差异显著。纵向来看，随着叶片的生长和成熟，淀粉粒含量呈增加趋势，在移栽后105天烤烟生理成熟期时，各处理下淀粉含量都达到最大。由结果可以看出，光强对叶片淀粉积累影响最为显著的时期是在移栽后105天即烟叶的生理成熟期以前，在叶片生理成熟期淀粉到达峰值随后在采收时样品中淀粉粒明显减少，颗粒完整度降低 (图1)，说明此时淀粉粒已发生明显的降解，在不同光强条件下的烟叶样品间没有明显差异，均处于减少、降解的状态。结果表明光照衰减对生长期烤烟叶片淀粉的合成和积累影响较大。

图1 各光强处理下及不同时期烟草叶片组织的电镜照片*Fig.1 Ultrastructure images of starch grains in tobacco leaf samples at different stages under different light intensity environments

2.2 光照衰减对淀粉和糖代谢途径基因表达的影响

电镜结果显示淀粉的积累主要发生在移栽后105天之前，通过RT-PCR方法对移栽后78d的扩展期叶片和85d成熟期叶片中目的基因表达量进行了检测(图 2)。结果显示受光强衰减的影响，有6个与淀粉和糖代谢相关基因的表达量发生了变化，分别为负责糖转化和合成的胞外转化酶(INV)，UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDD)，蔗糖合成酶(SuSy)，6-磷酸蔗糖磷酸酶(SPP2)，及负责淀粉合成的颗粒淀粉合成酶(GBSS I)与淀粉分支酶(SBE)[11-15]。

其中糖代谢关键酶INV，UGDD，SPP2基因不仅受光照强度的影响，在不同生长时期表达量也有显著差异，其在成熟期的叶片样品中表达量显著低于扩展期烟叶样品中的表达量。随着光照强度的减弱，基因表达量显著减少，特别是INV基因。SuSy基因的变化较为复杂，在扩展期的样品中表达量在自然光下表达较少，而在遮光条件下表达量增加，可能与烟叶的长势有关。在成熟期的样品中SuSy基因表达量则随光强的减弱逐渐减少，直至55%光照处理的样品中表达量几乎为零，整体表达都低于叶片扩展期各处理的表达量，表明随着烟草生长发育时期的延长，糖的合成也是逐渐降低的。糖代谢途径的4个关键基因控制着蔗糖的合成和转化，随着叶片成熟进程，这4个基因的表达逐渐降低，表明随着光强的减弱，在这些基因的影响下蔗糖的合成转化也会逐渐减少。

涉及淀粉代谢的基因中有两个关键基因GBSS I和SBE在处理间变化较为显著。淀粉合成的控制基因GBSS I受叶片生长时期的影响较大，而受光照影响较小。与扩展期烟叶样品相比，该基因在成熟期烟叶样品中大量表达，表明此时淀粉大量合成，导致移栽后105天时淀粉粒的积累达到高峰。淀粉含量不仅受淀粉合成途径的影响，也受糖含量的影响，由此可见前两个时期中光衰减导致的淀粉含量逐渐减少的主要原因是弱光抑制了糖分的合成和转化，因此导致淀粉含量的减少。颗粒淀粉合成关键基因GBSS I在叶片的扩展期表达量较弱，而在成熟期淀粉合成酶大量表达，这与电镜显示扩展期叶片淀粉含量较低，而之后逐渐增加的结果一致。结果也说明移栽后85天至移栽后105天叶片中淀粉大量合成导致了在随后移栽105天时各个光照强度处理条件下的淀粉含量均达到最高。SBE基因是催化直连淀粉向支链淀粉转化的酶，但对于淀粉的合成不起决定作用。结果显示SBE基因在两个时期均受到光照强度的影响，都呈随光强减弱先增加后减小的表达模式，但扩展期叶片SBE基因受光强的影响程度小于成熟期叶片。扩展期烟叶在85%的光照强度下SBE基因表达量最高，随后逐渐降低。而在成熟期烟叶样品中随光照减弱表达量降低更加明显，结果表明烟草叶片中直链淀粉向支链淀粉的转化受光照的影响较大。

图2 糖、淀粉途径关键基因在不同光强处理下及不同时期表达量的变化

2.3 光照衰减对氮代谢途径基因表达的影响

试验中对氮代谢途径7个关键基因表达量进行了检测，包括谷氨酰胺合成酶（GS）两个同工酶 (GS1-3与GS1-5)、硝酸还原酶基因（Nit）、谷氨酸脱氢酶（Gdh1）和亚硝酸还原酶三个同工酶基因(Nir-1, Nir-2和Nir-3)(图3)。亚硝酸还原酶、谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶都是氮代谢途径中氮还原的关键酶，控制着硝态氮向铵离子的转化及铵离子的同化，两个步骤紧密相连[16]。

结果显示由于GS1-3和GS1-5是同工酶，两个基因的表达呈较为明显的互补趋势，表明两个基因对光强变化的反应有差异，整体来看扩展期叶片谷氨酰胺合成酶基因的表达在不同光强处理下没有明显的规律性，在100%自然光下表达量最弱，弱光处理下表达量有所增加。成熟期叶片各光强处理下表达量互相补充，差异性较小，整体略高于扩展期叶片的表达量。Gdh1谷氨酸脱氢酶在成熟期叶片中表达量随光强变化较为规律，随着光强减弱，其表达量逐渐增加。亚硝酸还原酶的三个同工酶Nir-1、Nir-2和Nir-3基因表达趋势与GS同工酶相似，表达具有互补效应，Nir-2基因受光照影响最大，在弱光下表达量高于自然光条件下表达量。亚硝酸还原酶与谷氨酸脱氢酶两个关键酶在弱光处理下表达模式一致，均在弱光条件下表达较强，表明氮同化代谢在弱光条件下维持在较高的水平，这可能与在弱光下叶片氮代谢滞后有关。

图3 氮代谢途径关键基因在不同光强处理下及不同时期表达量的变化

3 结论

光强衰减可以导致烟草叶片淀粉含量的降低，糖的合成基因受弱光影响表达显著降低，淀粉合成酶表达量不受光强的影响，在烟草生长的成熟期大量表达，在移栽后105天时各光强处理下淀粉含量均达到最高，之后淀粉开始降解,弱光促进氮代谢途径关键酶的表达从而适度增强了氮代谢生理过程。烤烟叶片糖和氮代谢途径受光强的衰减影响最大。

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Effects of light attenuation on expression of pivotal genes in carbon and nitrogen metabolism in tobacco leaves

YANG Huijuan1, WANG Hongli1, SHI Hongzhi1，CHEN Yongming2
1 Henan Agricultural University, National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Key Laboratory for Tobacco Cultivation of China Tobacco, Zhengzhou 450002, China;2 Nanxiong Tobacco Research Institute, Guangdong Province, Nanxiong 512400, China

Electrical microscope and reverse transcriptional PCR were used to study starch accumulation and genes expression involved in starch, sugar and nitrogen pathway in tobacco leaves.Four light attenuation treatments (100%, 85%, 70% and 55% of natural light intensity respectively) achieved by shading were applied and tobacco leaves were sampled at 78d, 85d, 105d after transplanting and 120d at harvesting.Results showed that starch reacted the strongest to light intensity.It decreased with the reduction of light intensity before 105d.Expression of four genes involved in sugar metabolism became lower with the decrease of light intensity and also in line with tobacco maturing process.GBSSIgene expressed at a low level in samples on 78d during which tobacco leaf was in the progress of expansion,while gene expression increased dramatically on 85d when leaves had entered maturing stage.The expression of isoenzyme genes ofNirfamily and GS family showed certain complementary effect.The expression level of genes in general decreased with light attenuation,indicating that low light intensity delayed nitrogen metabolism expression.

fl ue-cured tobacco; light intensity; starch; gene expression

杨惠娟，王红丽，史宏志,等.光强衰减对烟草叶片碳氮代谢关键基因表达的影响[J].中国烟草学报，2015,21（5）

中国烟草总公司浓香型特色优质烟叶开发重大专项项目（Ts-01-2011002）

杨惠娟（1978—），博士，副教授，硕士生导师，从事烟草分子生物学研究，Email：huijuan@zju.edu.cn

史宏志（1963—），博士，教授，博士生导师，从事烟草栽培生理研,Email:shihongzhi88@163.com

2015-01-28

:YANG Huijuan, WANG Hongli, SHI Hongzhi , et al.Effects of light attenuation on expression of pivotal genes in carbon and nitrogen metabolism in tobacco leaves [J].Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(5)