轮台土种绒山羊KIF-I基因第1、3外显子的多态性分析

吾布力·沙地克，买买提·热合曼，依明·苏来曼

（1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2．新疆轮台县畜牧兽医站）

轮台土种绒山羊KIF-I基因第1、3外显子的多态性分析

吾布力·沙地克1，买买提·热合曼2，依明·苏来曼1

（1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2．新疆轮台县畜牧兽医站）

研究以轮台土种绒山羊为研究对象，利用Primer 5.0软件设计出1对引物,以成年山羊基因组DNA为模板,扩增山羊的KIF-I基因，采用PCR-SSCP技术研究轮台绒山羊KIF-I基因外显子1、3的基因多态性。结果表明：①KIF-I基因外显子1存在两种基因型：AA型、AB型；AA基因型频率0.36，AB基因型频率0.64。其中A等位基因频率0.82，B等位基因频率0.18。基因纯合度0.705，基因杂合度0.295。②KIF-I基因外显子3在轮台土种绒山羊品种上未发现多态性。

轮台绒山羊；PCR-SSCP；KIF-I基因；遗传多态性

新疆山羊是分布于新疆全境，绒、肉、乳、皮兼用的原始地方品种。该品种山羊绒纤维具有纤细柔软、强丝光、强力大、净绒率高等特点，对于发展细绒型山羊有着重要意义。但该山羊存在体格小、成熟较晚、生长发育缓慢、产绒量低等不足，严重阻碍了新疆山羊产业化发展。国内外对绒山羊绒毛性状遗传参数的研究以及有关营养水平、微量元素、光照、褪黑激素、季节性生长模式等对绒毛性状和品质影响的研究报道较多，但绒山羊饲养者往往只注重产绒量的提高，而忽视绒毛品质和产量的变化规律，致使绒山羊饲养经济效益低，群体产绒潜力得不到充分发挥。努力提高山羊的产绒量和羊绒品质，是近年来绒山羊培育的主要方向。

当前分子遗传学技术飞速发展，为家畜品种资源多样性的研究和保护提供了良好的契机，DNA分子标记技术在山羊遗传多样性研究中发挥着重要作用。由于羊毛纤维本身具有高度的组织结构，其中纤维的90%是由角蛋白中间丝（keratin intermediate filament，KIF）和角蛋白辅助蛋白（keratin-associated protein，KAP）构成。KIF蛋白有2个家族，即KIF-Ⅰ酸性（keratin intermediate filament typeⅠ）和KIF-Ⅱ碱性（keratin intermediate filament typeⅡ）角蛋白。绵羊的KIF-Ⅰ和KIF-Ⅱ基因分别位于染色体11q25～q29和染色体3q14～q22，其中KIF-Ⅰ基因长4～5 kb，包含6个内含子；KIF-Ⅱ基因长7～9 kb，包含8个内含子。在羊毛发育过程中，等量的酸性（Ⅰ型）和碱性（Ⅱ型）角蛋白配对形成8～10 nm的细丝，填充在KAP的基质之间。目前，国内外对产绒性能的相关性研究主要集中在KAP基因方面，而以新疆（绒）山羊为研究对象，以KIF基因为候选基因的研究报道较少。本研究对轮台绒山羊KIF-I基因外显子1、3的多态性及其与产绒性状的关系进行研究，以期为绵（绒）山羊的育种提供一定的遗传学理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样本的采集选择新疆轮台县健康无病的山羊100只作为试验材料。采集山羊颈部静脉血样5～8 mL，EDTA-K2抗凝，带回实验室置于-20℃长期冻存。

1.1.2主要药品和试剂Taq DNA聚合酶，上下引物，dNTPs，Marker，Tris饱和酚，6×Loading Buffer，10×PCR Buffer，三氯甲烷，EDTA，NaCl，Tris·HCl，SDS，无水乙醇，溴化乙锭，硼酸，二甲苯氰，过硫酸铵，溴酚蓝，琼脂糖，变性剂，聚丙烯酰胺，染色液，超纯水。

1.2.3主要试验仪器Eppendorf移液器，超净工作台，BIOFUGE PRIMOR型低温离心机，JY04S型凝胶成像仪，Mini-6K型微型离心机，PCR仪（050-810 Tgradient48型），DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳槽。

1.2方法

1.2.1血液基因组DNA的提取 采用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，溶于TE中，-20℃保存；用1.2%～1.5%的琼脂糖检测提取的基因组DNA的效果并估算其浓度。

1.2.2引物设计及PCR扩增 根据GenBank上的绒山羊基因序列（登录号：GQ-988385）设计一对特异性引物，由上海生工生物工程公司合成，引物序列、大小等见表1。PCR反应体系 20 μL，上下游引物各 0.6μL，模板DNA1.5 μL，PCR Green Mixture10 μL，加超纯水至20 μL；反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s，经过30次循环，72℃延伸5 min后，4℃保存。

表1　KIF-Ⅰ基因外显子1、3引物序列

1.2.3利用PCR-SSCP分析多态性PCR产物的SSCP分析方法参考王旭等的方法进行。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若出现特异性条带，且条带清晰、大小和质量符合要求，则用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，经银染法脱色、显色液显色，最后用凝胶成像系统成像。

2　结果与分析

2.1基因组DNA提取结果

基因组DNA提取结果见图1。可见DNA条带清晰明亮，纯度好，适宜进行相关的PCR扩增。

图1　轮台绒山羊血液基因组1%琼脂糖检测结果

2.2KIF-Ⅰ基因外显子1的群体遗传变异分析

2.2.1KIF-Ⅰ基因外显子1的PCR产物检测对轮台绒山羊KIF-Ⅰ基因外显子1的引物进行PCR扩增，扩增结果用2%琼脂糖检测（图2）。结果显示，KIF-Ⅰ基因外显子1的片段长度为251 bp，与预期大小相符。

图2　轮台绒山羊外显子1 PCR产物电泳结果

2.3KIF-Ⅰ基因外显子1的PCR-SSCP结果

PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到2种（AA，AB）基因型（图3）。其中第1、2、3、5、6、7、10泳道为AB型，第4、8、9泳道为AA型。

图3　轮台绒山羊PCR产物电泳结果

2.2.2KIF-Ⅰ基因外显子1的序列分析根据PCR-SSCP分析结果，选取2种基因型的PCR产物送上海生工生物工程公司测序。将测序结果与山羊KIF-Ⅰ基因序列（GenBank登录号：GQ-988385）进行比较（图4）。测序结果表明，轮台绒山羊KIF-Ⅰ基因外显子1片段长度为251 bp，分析序列个体数为10，对测序的DNA序列用DNAMAN软件进行多序列比较后发现，在KIF-Ⅰ基因外显子1上DNA序列的第429位点出现了C→A变异（图5）。

图4　轮台绒山羊外显子1引物扩增片段的核苷酸序列同源性比较

图5　不同基因型测序结果

2.2.3KIF-Ⅰ基因外显子1型频率和等位基因频率及遗传特性 在所检测的轮台绒山羊群体中，KIF-Ⅰ基因外显子1的AA、AB两种基因型的频率分别为0.64和0.36。等位基因A、B的频率分别为0.82和0.18。KIF-Ⅰ基因的引物扩增产物在轮台绒山羊处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）。

根据电泳结果，计算轮台土种绒山羊KIF-Ⅰ基因外显子1的基因纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量。结果表明，轮台绒山羊基因外显子1的基因纯合度为0.705，基因杂合度为0.295，有效等位基因数1.419，多态信息含量（PIC）0.252。根据确定位点多态性的标准，轮台绒山羊KIF-I基因多态位点属于中度多态（0.25

2.3KIF-Ⅰ基因外显子3的群体遗传变异分析

2.3.1PCR扩增结果 提取的DNA样品进行PCR扩增，产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测。图6为KIF-1基因外显子3的扩增产物，扩增片段长度与所预测的片段长度一致。

图6　轮台绒山羊外显子3 PCR产物电泳结果

2.3.2KIF-Ⅰ外显子3基因PCR-SSCP分析 PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，未发现存在任何变异位点。

2.3.3KIF-Ⅰ基因外显子3不同基因型序列分析根据SSCP结果选出8个KIF-Ⅰ外显子3的PCR扩增产物送上海生工测序。测序结果用DNAMAN软件进行多序列快速分析。结果显示，8个样品的测序结果都一样，没有碱基突变、缺失等现象。KIF-Ⅰ基因外显子3只存在一种基因型（AA），没有多态性。根据设计引物的原序列（GenBank序列号为Ga988385）与KIF-Ⅰ基因外显子3 PCR扩增产物进行对比，证实PCR产物测序后的序列与原序列一样，没有突变。

3　讨论

3.1山羊KIF-Ⅰ基因外显子1群体遗传变异

方光新等[1]从群体遗传学角度分析统计了3个山羊群体在KIF-I-P1酶切位点基因型、等位基因频率。在3个山羊群体中，A为优势等位基因，在新疆山羊、南疆绒山羊、博格达白绒山羊中的频率分别为0.700、0.729、0.747；AA型为优势基因型，在新疆山羊、南疆绒山羊、博格达白绒山羊中的频率分别为0.505、0.506、0.562。外显子1上T>C的突变为错义突变，引起氨基酸C→R的变化。T.O.Itenge-Mweza等使用PCR-SSCP技术在美利奴羊上做过类似的研究，得到5种基因型，发现3处突变。

本研究所检测的轮台绒山羊群体中，KIF-Ⅰ基因第1外显子的AA、AB两种基因型的频率分别为0.64和0.36，等位基因A、B的频率分别为0.82和0.18。本研究结果与其他人的结果不一致。

3.2山羊KIF-Ⅰ基因外显子3群体遗传变异

方光新等[1]利用KIF-1基因家族对新疆3个地方山羊品种进行研究，结果表明：KIF-1基因外显子3处3212位存在C→T的突变，减少一个HaeIII酶切位点，检测到AA、AB、BB三种基因型，A为优势等位基因，在新疆绒山羊、南疆绒山羊、博格达白绒山羊中的频率分别为0.823、0.777、0.883。此突变没有引起氨基酸的变化，为同义突变。

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S827.2

A

2095-3887（2015）02-0005-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.02.002

2014-12-10

吾布力·沙地克（1956-），男，维吾尔族，副教授，硕士生导师。

依明·苏来曼，男，维吾尔族，副教授，硕士生导师。研究方向：动物遗传育种。