中国美利奴羊（新疆型）KRT27基因的多态性及其与毛细度性状关联分析

石晓雷，马依拉·吐尔逊，刘春洁，米亚沙热·迪里木热提，田月珍，詹振宏，艾买提·买买提，黄锡霞，田可川

（1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000）

遗传育种

中国美利奴羊（新疆型）KRT27基因的多态性及其与毛细度性状关联分析

石晓雷1，马依拉·吐尔逊1，刘春洁1，米亚沙热·迪里木热提1，田月珍1，詹振宏1，艾买提·买买提1，黄锡霞1，田可川2

（1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院畜牧研究所，乌鲁木齐 830000）

实验通过PCR-SSCP技术,对中国美利奴羊（新疆型）KRT27基因的多态性进行了检测，并对不同基因型与中国美利奴羊（新疆型）羊毛细度性状间的关联性进行了分析。结果表明:外显子5的一段长度为122 bp的扩增产物经SSCP分析后出现了两种基因型AA和AB，存在两种等位基因A和B；AA基因型和AB基因型在中国美利奴羊（新疆型）中的频率分布分别为0.86和0.14，等位基因A、B的基因频率分别为0.93和0.07，表明A等位基因为优势等位基因；所研究群体在该位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。不同基因型的个体间羊毛细度性状没有显著差异（P>0.05）。

中国美利奴羊（新疆型)；KRT27基因；多态性；羊毛细度

中国美利奴羊（新疆型）是以澳洲美利奴公羊与波尔华斯羊、新疆细毛羊通过杂交培育而成，自从1985年育成之后，逐渐成为新疆地区细毛羊的主要品种［1］。该品种体格大，呈长方型；被毛白色，呈毛丛结构，密度大，细度60～70支，以64～66支为主。利用动物个体表型差异和基因型差异之间的关联性来预测影响动物性状的主效基因已经成为较为重要的现代育种方式之一。KRT是keratin intermediate filament的缩写形式，又可写为KRT-IF（角蛋白中间丝蛋白），是角蛋白家族的重要成员，是形成毛发、角和指甲的主要成分［2］。KRT-IF有I型（酸性）和Ⅱ型（碱性）两种类型，I型KRT-IF基因含有4～5 kb个碱基对，有6个内含子；II型KRT-IF基因含有7～9 kb个碱基对，有8个内含子；KRT27基因属于Ⅰ型基因。Bawden等［3］将带有标签的毛角蛋白Ⅱ型中间丝（keratintypeⅡintermediate filament，KIFⅡ）基因导入绵羊，获得的转基因绵羊羊毛品质得到显著改善，毛纤维具有较高的光泽和显著的柔韧性。利用原位杂交对其研究表明，I型IFs在绵羊毛囊内根鞘表达丰富，Ⅱ型KRT-IF在皮层高效表达，而改变羊毛纤维的微观结构和宏观结构，包括增加羊毛的光泽度和降低羊毛的弯曲度及细度［4］。Langbein L等［5］报道在人类毛发中角蛋白KRT38分布在皮质层的皮质细胞中，KRT38基因表达的角蛋白是低硫蛋白，它们形成了毛发纤维的微原纤维成分。

近年来国内外对绵、山羊KRT基因的研究主要集中在基因克隆和表达方面，Grant W等［6］采用PCR-SSCP技术研究5'非翻译区（UTR）绵羊KRT2.13基因的多态性，发现了多个不同类型的突变，并且影响基因表达和羊毛性状。吴茜［7］构建了新吉细毛羊皮肤组织全长cDNA文库，通过序列表达标签测序发现KRT27基因可能影响绵羊毛性能。本研究就是在此基础上，将KRT27基因作为候选基因，采用PCR-SSCP技术对中国美利奴羊（新疆型）的KRT27基因多态性进行了检测，并对不同基因型与中国美利奴羊（新疆型）的羊毛细度性状之间的关联性进行了分析，以期探索是否存在与羊毛细度有关的SNP位点。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物与数据来源实验对象为中国美利奴羊（新疆型），由新疆巩乃斯种羊场提供，共206只，均为成年母羊。静脉采血3～5 mL，EDTA抗凝冷冻保存、备用。收集并整理在新疆巩乃斯种羊场2007—2008年的中国美利奴羊（新疆型）羊毛细度鉴定记录。

1.1.2主要试剂和设备Taq DNA聚合酶、dNTPs、10× PCR Buffer、Marker D2000等均为生工生物公司产品；My Cycler型PCR仪；DYY-6C型电泳仪；Gel Doc 2000型凝胶成像系统等。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取采用常规的苯酚/氯仿法制备，所提取的基因组DNA利用琼脂糖凝胶电泳检测提取结果的完整性。用分光光度计测定其浓度值及OD260/OD280值，取浓度大于50 μg/mL，OD260/OD280值在1.8～2.0间的样品-20℃冷冻备用。并用琼脂糖凝胶电泳进行完整性检测，用分光光度计进行浓度和纯度检测。

1.2.2引物设计合成根据牛的KRT27基因（GenBank登录号-001075815）外显子5序列，用Primer 5.0引物设计软件，设计1对引物，序列为上游引物：5'-GCGGATGTCAGTAGTTTGC-3'；下游引物：5'-TCTCCTCCTCGTGGTTCTT-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3PCR反应体系的建立及扩增PCR反应体系：基因组DNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1.6 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加灭菌纯水至总体积为20 μL。PCR扩增反应条件：95℃预变性3 min；94℃30 s，50.3℃30 s，72℃30 s，共进行35个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后用于SSCP分析。

1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳检测适量PCR产物经变性处理后，通过12%非变性聚丙烯酰胺凝胶在0.5×TBE条件下进行电泳。电压180 V，电泳14～16 h。电泳结束后取下凝胶，进行固定、银染和显色。观察分析不同的带型并用凝胶成像系统进行拍照并保存。

1.3数据统计分析

根据SSCP检测结果判定基因型（AA型和AB型）。应用EXCEL软件分析其基因频率、基因型频率和其他遗传特性。应用SAS软件分析KRT27不同基因型与中国美利奴羊（新疆型）羊毛细度之间的相关性。

2　结果与分析

2.1中国美利奴羊（新疆型）KRT27基因PCR检测以绵羊基因组DNA为模版进行PCR扩增得到长度为122 bp的特异条带。从图1可以看出，PCR扩增结果与预期扩增片段大小一致，而且没有非特异性扩增条带，一致性较好，可以用于多态性检测。

图1　KRT27基因的PCR扩增结果电泳图

2.2KRT27基因的SSCP多态性检测

将扩增的KRT27基因的PCR产物进行PCR-SSCP分析，结果发现该片段在中国美利奴羊（新疆型）群体中存在两种基因型，分别命名为AA、AB型，见图2。

图2　KRT27基因扩增产物的PCR-SSCP电泳图

2.3KRT27基因在中国美利奴羊（新疆型）的频率分布

统计结果如表1所示，在中国美利奴羊（新疆型）品种中检测到AA和AB两种基因型，卡方检验表明中国美利奴羊（新疆型）群体在该位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。

表1　KRT27基因的基因型频率和等位基因频率

处理后的数据经过分析计算得到KRT27基因片段在样本含量为206的中国美利奴羊群体中的遗传特性为：基因纯合度为0.87，基因杂合度为0.13，有效等位基因数为1.15，多态信息含量为0.122。根据确定位点多态性的标准：PIC<0.25，为低度多态位点；0.250.5，为高度多态位点。表明本试验中KRT27基因属于低度多态位点。

2.4不同基因型与羊毛细度的关联分析

实验对不同基因型与中国美利奴羊（新疆型）羊毛细度性状的关联性进行了分析。结果表明：不同基因型个体细度性状无显著差异（P>0.05）。

表2　KRT27基因不同基因型之间差异显著性检验

3　讨论

3.1实验分析方法的探讨

PCR-SSCP技术是已经相当成熟的研究基因多态性的技术，如果已知基因及其可能的调控功能，则可以利用该技术进行基因型和动物经济性状的关联性分析，从而验证基因对性状的影响，从侧面反映基因的调控机制。本实验经过PCR-SSCP分析，结果产生两种带型，AA和AB，这两种基因型对中国美利奴羊（新疆型）细度性状没有显著差异（P>0.05），因此，KRT27作为中国美利奴羊（新疆型）羊毛细度性状的候选基因不合适。本实验数据来自巩乃斯种羊场，采集的样本较少、区域较集中，只能反映所研究群体的遗传特性，不足以代表中国美利奴羊（新疆型）的群体特性。本实验在进行PCR的引物设计时用牛的基因序列作为源序列，原因在于NCBI中的GenBank中尚未录入绵羊的KRT27基因序列，因此选取近缘牛序列中作为引物设计的源序列，在理论上虽然误差较大，但是是可行的。

3.2有关研究的探讨

目前对KRT基因进行的研究方面，在绵羊上，类型I（KRT1.n）和类型Ⅱ（KRT2.n）已经被定位于11号和3号染色体上，这种物理图谱已经通过连锁分析得到了证实［2］。田月珍［9］的研究结果显示，KRT26可以作为羊毛细度性状的候选基因，且在皮肤组织中的表达上调，即羊毛细度越细，基因的表达量越低。作为同样为编码羊毛纤维的结构蛋白，KAP（keratin-associated proteins，KAPs）和KRT都作为了调控羊毛细度性状的候选基因。许汉峰［10］以新疆不同毛品质的绵羊为研究基础，利用相似的技术对KAP基因进行了遗传多态性分析，结果表明不同基因型在羊毛长度性状上差异不显著，但其推断可能会在羊毛细度上存在差异。国外的研究结果表明，羊毛品质的调控是在KRTⅠ、Ⅱ共同参与的［11］。因此推断，KRT基因不是独立的调控而是不同的KRT基因共同起调控作用，甚至也会和其他的某些基因也有相互作用，这方面还有待进一步研究。

3.3下一步的实验思路

本实验中发现的突变基因带型过少，可能是引物扩增的的片段不全。本实验的结果只能说明引物扩增的片段内不同基因型在羊毛的细度上没有显著差异，但其他基因片段是否存在突变能够影响羊毛细度，需扩大KRT27基因的检测范围。进行多态性检测的目的是为了最终找到与羊毛性状有关的SNP位点，而不同基因的多态性与羊毛生产性状关联性分析在大样本的情况下才具备可靠性。接下来的进一步工作可以增加样本数量，提高关联性分析的可靠性；还可以在确定有显著关联的基因上进行进一步的测序分析其突变类型。或者对不同品种相同基因进行对比寻找其基因差异和性状差异之间的关联。当前生物技术迅猛发展，高通量测序技术使得全基因组测序或者全基因测序成为现实。这样寻找SNP突变位点更加全面准确，本实验中的基因型对毛细度影响不显著，因此没有进行进一步的测序分析。

4　结论

KRT27基因中存在AA、AB两种基因型。基因型频率分别为0.86和0.14；等位基因A、B的基因频率分别为0.93和0.07。KRT27基因中，基因纯合度为0.87，杂合度为0.13，基因的PIC为0.122，属于低度多态位点。中国美利奴羊（新疆型）中不同基因型个体羊毛细度性状没有显著差异（P>0.05）。

［1］ 李武臣，宫平，高维明，等.中国美利奴羊（新疆型）毛密品系主要生产性能遗传力估测［J］.新疆畜牧业，2009，5：25-26.

［2］ McLaren R J，Rogers G R，Davies K P，et al.Linkage mapping of wool keratin and keratin-associated protein genes in sheep［J］.Mammalian Genome，1997，8：938-940.

［3］ Bawden C S，Sivaprasad A V，Verma P J，et a1.Expression of bacterial cysteine biosynthesis genes in transgenic mice and sheep：toward a new invivo amino acid biosynthesis pathway and improved wool growth［J］. Transgenic Research，1995，4（2）：87-104.

［4］Bawden C S，McLaughlan C，Nesei A，et al.A unique type I keratin intermediate filament gene family is abundantly expressed in the inner roots heaths of sheep and human hair follicles［J］.The Journal of Investigative Dermatology，2001，116（1）：157-166.

［5］ Langbein L，Rogcrs MA，Winter H，et al.The catalogue of human hair keratins.Expression of the nine type Ⅰ members in the hair follicle［J］. Journal of Biological Chemistry，1999，274：19874-19884.

［6］ Grant W Mckenzie，Reena Arora，Jon G H Hickford.Genetic variation in the 5′UTR of the KRT2.13 gene of sheep［J］.Animal Science Journal，2012，83（3）：194-198.

［7］ 吴茜.新吉中国美利奴羊皮肤组织均一化全长CDNA文库的构建及其ESTs的生物信息分析［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2010.

［8］ 刘桂芳.新疆优质中国美利奴羊遗传多样性及羊毛细度候选基因的分析［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2005.

［9］ 田月珍.中国美利奴羊（新疆型）羊毛细度相关候选基因的筛选及其关联性分析［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2008.

［10］许汉峰.角蛋白关联蛋白（KAP和KRT）与羊毛品质的关联性研究［D］.石河子：石河子大学，2008.

［11］Herrmann H，Hesse M，Reichenzeller M，et a1.Functional complexity of intermediate filament cytoskeletons：from structure to assembly to gene ablation［J］.Int Rev Cytol，2003（223）：83-175.

《中国草食动物科学》双月刊

《中国草食动物科学》是由中华人民共和国农业部主管、中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所主办的国家级科技核心期刊。于2012年4月由《中国草食动物》更名而成。《中国草食动物科学》为美国《化学文摘》（CA）收录期刊，中国科技核心期刊，中国农业核心期刊，RCCSE中国核心（扩展板）学术期刊；是中国科学引文数据库（CSCD）、中国科技论文与引文数据库、中国学术期刊综合评价数据库（CAJCED）和中国生物学文献数据库统计源期刊。

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《中国草食动物科学》主要刊登牛、羊、马、骆驼、鹿、兔、鸭、鹅、驼鸟、鱼等各种节粮型草食动物的最新科研成果和科技成就。主要栏目：遗传育种，繁殖与生理，营养与饲料，草地与牧草，疾病防控，专论与综述。

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Polymorphism of KRT27 Gene and Its Relationship with Fineness Traits in Chinese Merino Sheep（Xinjiang Type）

Shi Xiaolei1，Huang Xixia1，Tian Kechuan2，et al
（1.College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Institute of Animal Science，Xinjiang Academy of Animal Sciences，Urumqi 830000，China）

In this study，PCR-SSCP analysis was used to identify genetic variation in KRT27 in Chinese Merino（Xinjiangtype），and the relationship with fineness traits were analyzed.The results showed that a PCR product of 122 bp corresponding to partial exon 5 had two genotypes，and the frequencies of the genotype AA，AB and allele A，B in Chinese Merino sheep（Xinjiang type）were 0.86，0.14 and 0.93，0.07 respectively，and the A allele was dominant allele.The polymorphic locus of KRT27 gene was at Hardy-Weinberg equilibrium（P>0.05）in the breed.The individuals of genotype AA，AB had no significant difference in the fineness traits（P>0.05）.

Chinese Merino（Xinjiangtype）；KRT27 gene；polymorphism；fineness

S826.2

A

2095-3887（2015）02-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.02.001

2014-12-10

现代农业产业技术体系（CARS-40）；农业科技成果转化资金项目（2012GB2G400493）；紧缺人才专业大学生创新项目（jqrcp32010021）

石晓雷（1989-），男，在读硕士研究生。

黄锡霞（1963-），女，教授，博士生导师。研究方向：动物遗传育种；田可川（1963-），男，研究员。研究方向：细毛羊育种。