酰胺酶拆分制备左乙拉西坦手性中间体（S）-2-氨基丁酰胺的初步研究

郑仁朝，佘勇，郑裕国

（浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014）

酰胺酶拆分制备左乙拉西坦手性中间体（S）-2-氨基丁酰胺的初步研究

郑仁朝，佘勇，郑裕国

（浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014）

（S）-2-氨基丁酰胺是癫痫治疗药物左乙拉西坦的关键手性中间体。筛选获得了能够立体选择性拆分2-氨基丁酰胺合成（S）-2-氨基丁酰胺的重组酰胺酶Dt-Ami 6。考察了温度、pH、有机共溶剂及不同底物浓度对催化反应的影响。结果表明，该酶的最适催化温度为40℃，最适底物浓度为1 mol/L，湿菌体最适添加量为8 g/L，在去离子水中反应40 min，（S）-2-氨基丁酰胺的收率为41.7%，光学纯度达94.0%。

酰胺酶；立体选择性水解；（S）-2-氨基丁酰胺；左乙拉西坦

癫痫是一种由多种病因引起的慢性、反复发作性短暂脑功能失调综合症疾病。左乙拉西坦是比利时UCB公司开发研制的一种乙酰吡咯烷类新型抗癫痫药，化学名为（S）-α-乙基-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，化学结构与比拉西坦类拟［1］。该药不与其他抗癫痫药物发生相互作用，副作用轻微，耐受性好，因而成为广谱抗癫痫药物［2］。不仅用于难治性癫痫的辅助治疗，还扩展到诊断癫痫的单药治疗。2007年3月左乙拉西坦在国内上市，商品名为开浦兰。（S）-2-氨基丁酰胺是左乙拉西坦的关键手性中间体。目前，国内外已报道了化学合成（S）-2-氨基丁酰胺的工艺。如利用L-酒石酸或D-扁桃酸拆分制备（S）-2-氨基丁酰胺［3-8］；又如以L-蛋氨酸为手性源，经甲硫基羟化、溴代、酯化、脱卤和氨解生成（S）-2-氨基丁酰胺［9］；以S-2-氨基丁酸为手性源，经酯化、加压氨解生成（S）-2-氨基丁酰胺［10］。

生物催化具有反应条件温和、立体选择性严格和原子经济性高等优点，已成为最具发展前景的手性化合物制备方法。国内外已有酶法合成光学纯（S）-2-氨基丁酰胺的工艺报道。祝俊等［11］利用腈水合酶立体选择性水合2-氨基丁腈，从而获得了（S）-2-氨基丁酰胺，收率和光学纯度分别达到43%和89%；Owen等［12］利用具有立体选择性氨基肽酶水解外消旋2-氨基丁酰胺，从而获得了（S）-2-氨基丁酰胺，转化率和光学纯度分别达到49%和99%以上。

酰胺酶是一类能够催化酰胺水解生成相应羧酸的水解酶。由于酰胺酶具有较广的底物谱和立体选择性，成为手性化学品合成的重要工具酶［13］。本研究从实验室微生特库中筛选获得能够立体选择性水解外消旋2-氨基丁酰胺制备（S）-2-氨基丁酰胺制备（S）-2-氨基丁酰胺的酰胺酶产生菌，并考察温度、pH、有机共溶剂和不同底物浓度对催化反应的影响，为左乙拉西坦手性中间体的高效、绿色生产奠定基础。

1　实验方法

1.1产重组酰胺酶菌株的培养

27株产重组酰胺酶大肠杆菌工程菌由本实验室构建并保藏。菌种接种至斜面培养基活化，再接种至LB培养基（装液量为50 mL/250 mL三角摇瓶，含有50 μg/mL卡那霉素），37℃，150 r/min摇床转速下，培养10 h。再转接入LB培养基（装液量为50 mL/250 mL三角摇瓶，含有50 μg/mL卡那霉素），接种量2%（V/V），培养2 h后，加入10 μL 0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG），于28℃，150 r/min条件下诱导12 h。培养结束后，离心收集菌体，经0.85%的生理盐水洗涤2次后，收集菌体冷冻备用。

1.2薄层层析法筛选具有酰胺水解活力的菌株

取湿菌体0.1 g悬浮于10 mL去离子水中，底物浓度100 mmol/L，在35℃，180 r/min水浴摇床中转化4 h；转化结束后，取200 μL反应液加入30 μL HCl（6 mol/L），振荡混匀，终止反应。添加770 μL去离子水稀释5倍，在12 000 r/min下离心3 min，取上清液备用。用薄层色谱法检测菌株的活性。硅胶G板为层析板，展开剂为甲醇∶水= 85∶15（V/V），显色剂为0.2%的茚三酮。

1.3反应温度对酰胺酶活力的影响及温度稳定性

分别考察25、30、35、40、45和50℃反应温度对重组酰胺酶Dt-Ami 6立体选择性水解2-氨基丁酰胺的影响。转化体系组成为：10 mL各种缓冲液或去离子水，0.5 mol/L 2-氨基丁酰胺，4 g/L湿菌体。在180 r/min水浴摇床中转化4 h，每隔20 min取样一次，经衍生化后进行高效液相色谱分析。

考察35℃、40℃下重组酰胺酶Dt-Ami 6的热稳定性。将菌悬液置于上述温度的水浴中保温，每隔一定时间取样测定酶活。以0 h的酶活（E0）为标准，分别计算ln（E0/E），并以ln（E0/E）对时间作图。

1.4pH的影响

以去离子水反应体系为对照，考察柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（50 mmol/L，pH 5.0～6.0），磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 6.0～8.0）和Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 8.0～9.0）各pH对重组酰胺酶Dt-Ami 6活力的影响。

1.5有机共溶剂的影响

考察甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、二甲基亚砜、四氢呋喃和异丙醇7种有机共溶剂对重组酰胺酶Dt-Ami 6选择性水解2-氨基丁酰胺的影响，有机溶剂添加量为10%（V/V）。

1.6不同底物浓度的影响

考察不同底物浓度对重组酰胺酶Dt-Ami 6水解2-氨基丁酰胺的影响，底物浓度范围为0.5～3.0 mol/L，40℃，180 r/min水浴摇床中转化4 h，定时取样，经衍生化后进行高效液相色谱法分析。

1.7分析及计算方法

取稀释50倍后的转化液500 μL，然后添加500 μL的衍生化试剂（衍生化溶液的配制：分别称取10 mg邻苯二甲醛（OPA）和12 mg N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）［14］，以l mL无水乙醇溶解后，用0.2 mol/L硼酸缓冲液（pH 9.8）稀释至5 mL，4℃冰箱保藏备用）混匀，静置5 min，然后取适量的衍生化后的样品采用手性高效液相色谱法分析底物。高效液相手性检测条件：Welchrom C18（4.6× 250 mm column）柱，流动相为甲醇∶乙酸铵（0.05 mol/L）=45∶55（V/V），流速为1 mL/min，柱温为35℃，进样量5 μL，荧光检测的激发波长为350 nm，发射波长为450 nm。对映体过量值（e.e.）、转化率（c）及对映体选择率（E）的计算参考Rakels［15］等的计算方法。（R）-2-氨基丁酸、（S）-2-氨基丁酸、（S）-2-氨基丁酰胺和（R）-2-氨基丁酰胺的保留时间分别为3.7、4.6、12.0和14.1 min。

1.8酶活定义

酶活定义：40℃下，每分钟产生1 μmol的2-氨基丁酸所需的酶量定义为一个酶活单位，即1 U。

2　结果与讨论

2.1立体选择性酰胺酶的筛选

用薄层色谱法考察了不同酰胺酶产生菌的2-氨基丁酰胺水解能力。利用该方法从27株菌株中筛选得到8株活性菌株（图1），其中W-4、W-yt、W-9、Dt-Ami 6 4株菌已完全水解2-氨基丁酰胺。然后分别取8株活性菌株的湿菌体5 g/L，底物浓度200 mmol/L，在35℃，180 r/min水浴摇床中转化4 h，每隔一定时间取样，经衍生化后进行高效液相色谱分析，测定底物和产物的光学纯度。从8株活性菌株中获得5株能够立体选择性水解2-氨基丁酰胺的菌株（表1）。W-9优先水解（S）-2-氨基丁酰胺，其余菌株则优先水解（R）-型单体，其中Dt-Ami 6的立体选择性最高，转化率为60.5%时，底物e.e.值达到93.6%（E值为14）。因此，选择Dt-Ami 6进行后续研究。

图1　薄层色谱法筛选能水解2-氨基丁酰胺的产酰胺酶菌株

表1　立体选择性水解2-氨基丁酰胺酰胺酶产生菌的筛选

2.2温度对酰胺酶活力的影响及温度稳定性

反应温度会影响生物催化剂的活性、立体选择性及稳定性［16-17］。由图2可知，在25～40℃之间，随着温度的升高，转化率变化不大。当温度高于40℃时，转化率显著下降。另一方面，反应温度对酶的立体选择性有一定的影响。在25～45℃范围内，随着温度的升高，E值随之提高，45℃时，E值达到34，当温度高于45℃后，E值开始下降。尽管在45℃时，E值达到最大，但底物的e.e.值仅为79.6%，原因是温度升高到45℃时，酶活损失较大，转化率仅能达到47.9%，不能将R构型的底物完全水解。综合考虑转化率、E值及底物的e.e.值，选择40℃作为反应温度。

图2　温度对重组酰胺酶Dt-Ami 6催化效果的影响

图3　重组酰胺酶Dt-Ami 6的温度稳定性

同时研究了35℃、40℃下重组酰胺酶Dt-Ami 6的热稳定性。35℃和40℃下该酶的失活常数分别为0.013和0.017（图3），半衰期分别为41.4 h和29.6 h，表明该重组酰胺酶Dt-Ami 6的热稳定性较好。

2.3pH的影响

反应体系中的pH通过影响酶及底物的解离状态从而影响酶的活性及立体选择性［18］。结果表明，在pH 5.0～9.0范围内，该酶保持较高的活性且底物的e.e.值也较高（93%左右）。另一方面，在pH 5.0～8.0的范围内，随着pH值的增大，E值也随之增大，当pH 8.0时，E值达到最大（18），当pH 8.0时，E值随之减小。结果表明，pH为8.0时，转化率为56.5%，底物e.e.值为91.4%，酶的催化效果最好，以去离子水为反应溶剂时，转化率为57.3%，底物e.e.值为92.6%。因此，从操作简便与经济角度考虑，后续研究选用去离子水为反应溶剂。

2.4有机共溶剂的影响

图5　有机共溶剂对重组酰胺酶Dt-Ami 6催化的影响

向反应体系中添加水互溶的有机共溶剂能够改变酶的活性及选择性，合适的有机共溶剂有助于酶发挥更好的活性和选择性。因此，考察了甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、二甲基亚砜、四氢呋喃和异丙醇7种有机共溶剂对重组酰胺酶Dt-Ami 6立体选择性水解2-氨基丁酰胺的影响。结果如图5所示，除了二甲基亚砜使酶能够保持较高活性，其他共溶剂对酶的活性均有一定的抑制，其中四氢呋喃的抑制作用最为显著；另一方面，所选的7种有机共溶剂都使酶的立体选择性显著下降，其中二甲基亚砜虽能保持较高的底物e.e.值，但转化率达到了66.5%。因此，后续研究不添加任何有机共溶剂。

2.5不同底物浓度的影响

生物催化过程中高浓度底物往往会抑制生物催化剂的活性，同时也会影响其立体选择性［19］。然而在低底物浓度时，若酶的活性中心未被饱和，就会造成酶的浪费。因此，考察了不同底物浓度对拆分效果的影响。当底物浓度从0.5 mol/L增至2 mol/L时，反应初始速率显著增加（57.8～109.1 mmol/min），随后保持稳定，说明随着底物浓度的增加，酶的活性中心趋于饱和。底物浓度增加至3 mol/L也未发现对酶的抑制作用。但是，底物浓度大于1 mol/L时，其立体选择性显著下降。底物浓度为3 mol/L时，E值仅为5。这可能是由于在高底物浓度下，底物与酶之间的疏水作用使酶的活性中心构象发生变化，使立体选择性降低。类似的立体选择性对底物浓度的依赖现象也见于腈水解酶和脂肪酶催化的反应中［20-22］。

图6　底物浓度对反应初速度及选择性的影响

2.6重组酰胺酶Dt-Ami 6立体选择性水解2-氨基丁酰胺进程

在最优反应条件下，考察了重组酰胺酶Dt-Ami 6立体选择性水解1.0 mol/L 2-氨基丁酰胺的过程（湿菌体量8 g/L）。如图7所示，反应40 min转化率达到58.3%，底物e.e.值达到94.0%。

3　结论

本研究筛选获得了能够立体选择性拆分合成左乙拉西坦手性中间体（S）-2-氨基丁酰胺的重组酰胺酶Dt-Ami 6，并考察了反应条件对催化反应的影响。以去离子水为反应体系，在最优条件下反应40 min，（S）-2-氨基丁酰胺的e.e.值和产率分别达到94.0%和41.7%。由于该酰胺酶的活力高，菌体用量仅为8 g/L（湿重），因此在合成左乙拉西坦关键手性中间体中具有较好的应用前景。但该酰胺酶对外消旋2-氨基丁酰胺的立体选择性还有待加强，以提高产品的光学纯度和收率。目前有关该酰胺酶的分子改造工作正在进行了中，从而使其适于工业化应用。

［1］GOWER A J，NOYER M，VERLOES R，et al.Ucb L059，a novel anti-convulsant drug：pharmacological profile in animals［J］.European Journal of Pharmacology，1992，222（3）：193-203.

［2］DECKERS C L P，KNOESTER P D，DE HAAN G J，et al.Selection criteria for the clinical use of the newer antiepileptic drug［J］.CNS Drugs，2003，17（6）：405-421.

［3］李毅亮，赵倩，鲍玉荣，等.（S）-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺的合成新工艺：中国，1583721A［P］.2005-02-23.

［4］陆孙彬，周乔，周士涛.一种S-2-氨基丁酰胺盐酸盐的合成方法：中国，103012190A［P］.2013-04-03.

［5］史宝珠，蔡彤，阙利明.手性药物左乙拉西坦中间体（S）-（+）-2-氨基丁酰胺盐酸盐的合成、拆分与消旋：中国，101130504A［P］.2008-02-27.

［6］杨占杰，马岩，程恩喜.一种（S）-2-氨基丁酰胺盐酸盐的制备方法：中国，102898324A［P］.2013-01-30.

［7］姚文学，刘志东.生产左乙拉西坦的中间体L-2-氨基丁酰胺盐酸盐的工艺方法：中国，101928229A［P］.2010-12-29.

［8］BOESTEN W H J，BOONEN J J C J，WOESTENBORGHS P L. Process for the resolution of aminobuty-ramide：EP，2524910 A1［P］.2012-11-21.

［9］齐陈泽，曾敏峰，沈永淼，等.S-2-氨基丁酰胺生产方法：中国，101575300A［P］.2009-11-11.

［10］ACHARYULU P V R，RAJU C M H.Preparation of amino acid amides：US，200518226 A1［P］.2005-02-16.

［11］祝俊，陶军华，苏金环，等.一种用酶法制备（S）-2-氨基丁酰胺的方法：中国，102260721A［P］.2011-11-30.

［12］OWEN G，ROBERT J J，GJALT H，et al.Amidase and methods of their use：US，20120021469 A1［P］.2012-01-26.

［13］郑裕国，薛亚平，柳志强，等.腈转化酶在精细化学品生产中的应用［J］.生物工程学报，2009，25（12）：1795-1807.

［14］徐建妙，徐永鑫，郑裕国，等.柱前手性衍生化-RP-HPLC法拆分D，L-草铵膦［J］.农药，2013，52（3）：195-197.

［15］RAKELS J L L，STRAATHOF A J J，HEIJNEN J J.A simple method to determine the enantiomeric ratio in enantioselective biocatalysis［J］.Enzyme and Microbial Technolgy，1993，15（12）：1051-1056.

［16］POLIZZI K M，BOMMARIUS A S，BROERING J M，et al.Stability of biocatalysts［J］.Current Opinion in Chemical Biology，2007，11（2），220-225.

［17］ZHENG Renchao，WANG Yuanshan，LIU Zhiqiang，et al.Isolation and characterization of Delftia tsuruhatensis ZJB-05174，capable of R-enantioselective degradation of 2，2-dimethylcyclopropanecarboxa-mide［J］.ResearchinMicrobiology，2007，158（3）：258-264.

［18］ZHENG Gaowei，YU Huilei，ZHANG Jiandong，et al.Enzymatic production of l-menthol by a high substrate concentration tolerable esterase from newly isolated Bacillus subtilis ECU0554［J］.Advanced Synthesis and Catalysis，2009，351（3），405-414.

［19］KIM J H，CHOI G S，KIM S B，et al.Enhanced thermostability and tolerance of high substrate concentration of an esterase by directed evolution［J］.Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2004，27（4-6）：169-175.

［20］YULijuanXUYan，WANGXiaoqing，etal.Highlyenantioselective hydrolysis of DL-menthyl acetate to L-menthol by whole-cell lipase from Burkholderria cepacia ATCC 25416［J］.Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic，2007，47（3-4）：149-154.

［21］DESANTIS G，WONG K，FARWELL B，et al.Creation of a productive，highlyenantioselectivenitrilasethroughgene sitesaturation mutagenesis（GSSM）［J］.Journal of the American Chemical Society，2003，125（38）：11476-11477.

［22］ZHENG Renchao，LI Aipeng，WU Zheming，et al.Enzymatic production of（S）-3-cyano-5-methylhexanoic acid ethyl ester with high substrate loading by immobilized Pseudomonas cepacia lipase［J］.Tetrahedron：Asymmetry，2012，23（22-23）：1517-1521.

（责任编辑：朱小惠）

Amidase-catalyzed enantioselective synthesis of chiral intermediate of levetiracetam（S）-2-aminobutyramide

ZHENG Renchao，SHE Yong，ZHENG Yuguo
（Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

（S）-2-aminobutyramide is the key chiral intermediate of levetiracetam，an important drug for the treatment of epilepsy.A recombinant amidase Dt-Ami 6 was screened as the best biocatalyst for enantioselective synthesis of（S）-2-aminobutyramide.The reaction parameters including temperature，pH，organic cosolvent and substrate concentrations were investigated.The results indicated that the optimum temperature，substrate concentration，biocatalyst loading and reaction time were 40℃，1 mol/L，8 g/L and 40 min，respectively.Under these conditions，（S）-2-aminobutyramide was obtained in 41.7%yield and 94.0%e.e..

amidase；enantioselective hydrolysis；（S）-2-aminobutyramide；levetiracetam

TQ46

A

1674-2214（2015）03-0001-05

2015-04-20

国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA022201B）

郑仁朝（1980—），男，浙江奉化人，教授，博士，研究方向为手性生物催化，E-mail：zhengrc@zjut.edu.cn.通信作者：郑裕国教授，E-mail：zhengyg@zjut.edu.cn.