三聚氰胺降解菌的分离鉴定及其生物炭固定化研究

付 盼，周 辉，赵雨薇，孙明星，沈国清

（1.上海交通大学 农业与生物学院，上海 200240；2.上海出入境检验检疫局，上海 200135）

三聚氰胺（Melamine）是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，分子式为C3N6H6.自2008年三聚氰胺食品污染事件发生后，环境中三聚氰胺的污染引起了国内外的广泛关注［1］.早在2007年，联合国粮农组织就曾指出，作为农药或动物杀虫剂使用的灭蝇胺，在分解后会产生三聚氰胺.除此之外，由于三聚氰胺的含氮量高达66.6%，有报道指出，我国每年生产的5.0×108kg三聚氰胺的废渣全氮含量为50.01%，可以制成肥料，为植物提供氮素营养［2－3］.然而，三聚氰胺本身所具有的水溶性差和土壤中难降解的特性，导致农作物对三聚氰胺中氮素的利用率较低［4－5］.现有研究表明，环境中的污染物主要通过生物降解途径从环境中缓慢消失，因此，污染物的生物降解受到了广泛关注［6－7］.

Daniel R Shelton等（1997）研究报道了Klebsiella terragena 菌对三聚氰胺的降解途径与机理［8］；Kazuhiro Takagi等（2012）从稻田土壤中筛选出了Nocardioides三聚氰胺降解菌，研究了三聚氰胺微生物降解过程中各产物的动态变化［9］.然而这些降解菌在实际环境中还无法形成优势菌，其生态稳定性较差.国内还未见有关土壤中三聚氰胺降解菌的研究报道.本文从农田土壤中成功分离出了1株高效降解三聚氰胺的菌株，并采用微生物生物炭固定法，对两种类型土壤中的三聚氰胺进行了生物降解试验，研究结果可为提高土壤中三聚氰胺的降解提供新的途径.

1 材料与方法

1.1 材料

（1）供试土样：试验用水稻土和黑土分别采自上海市闵行区浦江镇和吉林省松原市农田土壤，过0.385mm 筛备用，供试土壤理化性质见表1.

（2）培养基：基础无机盐培养基（MSM）和Luria－Bertani培养基（LB）按参考文献［10］配制.

（3）主要试剂和仪器：三聚氰胺标准品（纯度≥99%）、乙腈、甲醇（色谱纯）、氨水、庚烷磺酸钠、柠檬酸由上海国药集团提供；PCR 和电泳等试剂购自上海星汉生物科技有限公司.UV－2401PC紫外可见分光光度计；PE200高效液相色谱仪，Tecnai G2Spirit Biotwin透射电子显微镜；TC－96／G／H（b）BPCR 仪；JY－600C三恒电泳仪.

表1 供试土壤理化性质Tab.1 Physical and chemical properties of soils

1.2 菌株的富集与筛选

取水稻土于锥形瓶中，加入生理盐水，振荡30s，用4层纱布过滤.将过滤液分别接入含10mg／L 三聚氰胺的无机盐培养基中，30℃，180r／min培养.每隔7d，提高三聚氰胺浓度10mg／L，直至三聚氰胺浓度至40mg／L.取富集培养液涂布于添加相应三聚氰胺浓度的无机盐平板上培养，30℃培养24h后，挑取生长较好的菌落进行纯化，并作为目标菌株保存备用.

1.3 初始pH 值和温度对降解菌株生长的影响

将降解菌株制成A600为1.0的菌悬液，吸取等量菌悬液以1%（体积分数）分别接入到pH 为5，6，7，8，9和10的含三聚氰胺的无机盐培养基中，37℃，180r／min培养，连续取样10d，测定初始pH 对菌株生长的影响；另外选取不同温度（27，32，37，42和47℃）分别培养，测定温度对菌株生长的影响；以上试验连续取样后，测菌体A600，每个处理设置3个重复，且设不接种菌为对照.

1.4 降解率测定

将降解菌株制成A600为1.0的菌悬液，以1%（体积分数）分别接入含有10，20，30，40，50mg／L 三聚氰胺的无机盐培养基中，37℃，180r／min摇床培养，设置不接菌的培养基为对照，每个处理设置3个重复，间隔1 天取样，连续2 周.所取培养液直接过固相萃取柱（Poly－Sery MCX SPE TUBES；40μm，60mg，3mL；CNW Technologies；通过甲醇活化），用氨水甲醇溶液（5／95，体积比）洗脱，收集洗脱液N2吹干，用20%甲醇溶液定容，过0.45μm 有机滤膜，用高效液相色谱检测其残留.色谱条件：色谱柱SPHERI－5RP－18（5μm，250mm×4.6mm），柱温为30℃；流动相为乙腈／庚烷磺酸钠－柠檬酸缓冲液（15／85，体积比），缓冲液配比为每500mL水含1.01g庚烷磺酸钠和1.05g柠檬酸；检测波长240nm，流速1.0mL／min，进样量10μL.根据标准曲线计算出样品中三聚氰胺的残留量，根据如下公式计算降解率.降解率（%）＝［1－（处理实测残留量／对照实测残留量）］×100%.

1.5 菌株对三聚氰胺的降解动力学分析

为了解菌株降解规律，采用下列描述底物浓度和降解速率之间定量关系的Monod方程，研究分析菌株对三聚氰胺的降解动力学：

式（1）中：v、vmax分别为底物的生物降解速率和最大底物的生物降解速率，mg／（L·h）；Km为米氏方程常数，mg／L；S 为底物浓度，mg／L.

通过实验测得最适条件下三聚氰胺浓度随时间变化的数据，将培养72～96h（对数期）中三聚氰胺含量与时间的半对数图做线性最小二乘拟合，计算出不同底物浓度对应的生物降解速率，然后采用双倒数法作图，得到1／v与1／S 的关系，计算确定菌株降解三聚氰胺的动力参数.

1.6 菌种的鉴定

（1）形态及生理生化鉴定：用光学和透射电子显微镜观察降解菌的形态，参照文献［11］对其进行生理生化鉴定，所用试剂盒为K2005革兰氏阴性杆菌生化鉴别试剂（BIO－KONT 20E，康泰生物科技有限公司）.

（2）分子鉴定：Axygen细菌基因组提取试剂盒提取菌株的总DNA，采用细菌的16SrRNA 通用引物，上游引物27F：5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’，下游引物1492R：5’－TACGGCTACC TTGTTACGACTT－3’；扩增出的序列酶切后连接到pMD18－T 载体，并转化E.coli感受态细胞筛选阳性克隆菌落［12］.PCR 引物合成及序列测定由上海赛百盛基因技术有限公司完成.利用GenBank数据库进行同源性检索，然后用软件MEGA6进行系统发育树的构建，确定菌株的种属关系.

1.7 生物炭及其固定化小球的制备

（1）生物炭的制备：对风干后的樟树枝条在烘箱中80℃下烘干，用高速万能粉碎机粉碎后500℃下限氧热解4h，制得实验所需生物炭.

（2）固定化小球的制备：称取1.0g生物炭，加入含有10mL菌悬液（A600＝1.0）的锥形瓶中，摇床培养12h.8 000r／min离心清洗得吸附载体，加入无菌水定容至20mL备用.包埋：将聚乙烯醇（PVA）和海藻酸钠（SA）按10%＋0.5%混合配成50 mL 水溶液，在水浴（90 ℃）中加热并连续搅拌溶解，冷却后（40℃）得混合胶体；交联：加入20mL上述吸附载体，用无菌水定容至100mL充分混匀后，用注射器将其滴入含4%CaCl2的饱和硼酸溶液中（NaOH 调pH 值至6.7），在4℃下静置24h，固化成球后备用.

1.8 固定化降解菌对土壤中三聚氰胺的降解

试验采用黑土和水稻土两种土壤，土壤样品经高压灭菌锅120℃灭菌20min后，准确称取500g样品，置于1 000mL烧杯中.加入含三聚氰胺的20%甲醇溶液，形成50mg／kg的土壤样品.两种土壤分别设置生物炭固定化菌、菌悬液、无菌生物炭固定化小球和空白对照4个处理，每处理重复3次.处理后的土壤样品置于30℃、湿度为40%的恒温培养箱中，连续培养35d，每隔一周取样检测三聚氰胺残留量，研究生物炭固定化降解菌对土壤中三聚氰胺的降解效果.在此基础上，分别配置含三聚氰胺50，100，200和400mg／kg的土壤，考察生物炭固定化降解菌降解效率.数据分析采用Excel、SPSS 和Origin 统计学软件.

2 结果与讨论

2.1 菌株生理生化特性

经过富集筛选后，共得到具有较强降解三聚氰胺的菌株10株，经进一步筛选，确定1株对三聚氰胺具有较高降解效率的菌株，编号为MB4.该菌株在30mg／L的三聚氰胺液体无机盐培养基中培养10d，降解效率达到81.67%，经过反复验证得知，该菌株降解重现性良好.菌株生理生化特性检测结果表明，在无机盐培养基上，菌落呈圆形，湿润，乳白色，边缘平整，表面凸起.生理生化特征见表2.图1为LB 液体培养基、37℃培养12h后，透射电子显微镜（20 000×）观察到的图片，菌体细胞为长杆状，无芽孢，长度3.2～5.5μm，宽度0.8～1.2μm.

表2 菌株MB4的生理生化特征Tab.2 Biochemical features of strain MB4

图1 三聚氰胺降解菌株MB4透射电镜照片Fig.1 Micrographs of melaminedegrading strain MB4

2.2 16SrRNA测序分析

将菌株MB4序列经16SrRNA 测序后，与GenBank数据库中的序列进行BLAST 比对，构建菌株MB4与其亲缘关系较近菌属的系统发育树，结果见图2.由图2可见，MB4与菌株AY741360.1（GenBank序列登录号）的同源性达99%，表明该菌株与洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）有很近的亲缘关系，其16SrRNA 序列长度为1 468bp，结合菌落形态、生理生化性质，参照《常见细菌系统鉴定手册》，将菌株MB4鉴定为洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cepacia.于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏号为：CGMCC No.9843.该菌株是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性细菌，也有报道指出该种属的一些细菌具有生物防治、促进植物生长和生物修复等功能［13－14］，然而作为三聚氰胺降解菌株却未见报道.

图2 菌株MB4的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain MB4

2.3 菌株MB4生长及其对三聚氰胺的降解动力学分析

由图3可见，菌株在0～2d时处于适应期，生长缓慢，对三聚氰胺的降解也较弱；2d后，菌株利用三聚氰胺作为营养物质，开始进入对数生长期，菌体量增加较快，对三聚氰胺的降解作用也增强；培养5d后，菌株处于最活跃阶段，生长量达到最大；6d后对数生长期结束，菌株进入衰退状态，对三聚氰胺的降解趋缓.

图4为采用Monod方程，通过双倒数法作图得到的1／v与1／S 的关系曲线.由图4可见，三聚氰胺为唯一碳源和氮源的生物降解速率在底物浓度为10～50mg／L 时，呈现出较好的线性关系，其相关系数R2＝0.986 3.菌株降解三聚氰胺的米氏方程为：

式（2）中，Km＝2.545mg／L.当S 远大于2.545mg／L 时，最大降解速率vmax＝1.24mg／（L·h）.说明，底物浓度在10～50mg／L时降解菌株具有快速降解能力.

图3 菌株MB4的生长和三聚氰胺的降解曲线Fig.3 Curves of stain MB4growth and melamine degradation

图4 1／v与1／S 的关系曲线Fig.4 The relation curve of 1／vand 1／S

2.4 初始pH 值和温度对降解菌MB4生长的影响

（1）初始pH 值对菌株生长的影响：培养基的pH 值会影响微生物对营养物质的吸收，从而促进或抑制微生物生长［15］.将菌株MB4分别接种于初始pH 值分别为5～10含三聚氰胺的无机盐培养基中，研究了初始pH 值对降解菌MB4生长的影响.结果表明，菌株在中性和碱性（pH≥7）条件下，生长速度较快，pH 值为8时菌株生长量最大，A600达到9.610；在初始pH 值为9和10的条件下，菌株生长量较小；而初始pH 值为5和6时，菌株受抑制且几乎停止繁殖（图5）.因此，菌株MB4最适生长的初始pH 值为7～8.这是因为一般细菌表面带有负电荷，大多数生长的环境要求中性或偏碱性，过高或过低的pH 值会使细胞表面电荷发生改变，进而影响细胞对营养物质的吸收［16］.

（2）温度对菌株MB4生长的影响：图6为不同温度条件下，菌株MB4在含三聚氰胺的无机盐培养基中的生长情况.由图中可见，菌体生长量随着温度升高出现先升高后降低的趋势，菌株的最适生长温度为37℃，此时的生物量最大，这是因为随着温度的升高，酶促反应速度相应提高，微生物的代谢速率与生长速率均相应提高，温度过高会导致细胞中蛋白质或核酸变性失活，导致菌体生长量降低.

图5 初始pH 值对降解菌MB4生长的影响Fig.5 Effects of different primary pH on strain MB4growth

图6 温度对降解菌MB4生长的影响Fig.6 Effects of different temperature on strain MB4growth

2.5 生物炭固定化降解菌对土壤中三聚氰胺的降解作用

图7为生物炭固定化降解菌对水稻土和黑土中三聚氰胺的降解作用，由图中可见，无论是水稻土还是黑土，在35d培养期内，不添加菌和炭的对照组（PS－CK 和BS－CK）中，几乎无三聚氰胺降解作用发生；菌液处理的水稻土（PS－B）和黑土（BS－B）中三聚氰胺的降解率分别为14.67%和21.86%；生物炭处理后，一周内水稻土和黑土中三聚氰胺的含量分别下降了13.6%和14.4%.这主要是由生物炭对三聚氰胺的吸附作用引起的；而添加生物炭固定化降解菌后，土壤中三聚氰胺的浓度显著下降，在35d培养期间，水稻土和黑土中三聚氰胺的浓度分别降低了67.34%和70.66%，表现为生物炭固定化降解菌对黑土中三聚氰胺的降解作用优于水稻土.表3 为生物炭固定化降解菌对黑土中不同浓度三聚氰胺的降解作用，经过35d培养后，生物炭固定化降解菌MB4对黑土中50～400 mg／kg 三聚氰胺的降解效率可达52.83%～70.33%.其降解动态符合Logistic方程Y＝A－A／［1＋（t／t0）n］，拟合系数均在0.95以上.式中Y 为土壤中三聚氰胺浓度；A 为土壤中三聚氰胺的最终降解率；t为降解时间；t0为半降解时间.

图7 生物炭固定化降解菌对不同土壤中三聚氰胺的降解作用Fig.7 Degradation of melamine in two soils bybiochar immobilized strain MB4

表3 生物炭固定化降解菌MB4对黑土中三聚氰胺的Logistic降解动力学模型各参数及统计指标Tab.3 Parameters and statistical indicators of melamine degradation Logistic Kinetic model in black soil by biochar immobilized stain MB4

（1）从农田土壤中分离筛选出了1株能以三聚氰胺为唯一碳源和氮源的三聚氰胺降解菌株MB4，经形态学观察、生理生化特征和16SrRNA 序列分析，初步鉴定为洋葱伯克霍尔德菌.

（2）菌株MB4能够在三聚氰胺浓度为10～50mg／L的无机盐培养基中正常生长，10d内对30mg／L三聚氰胺的降解率可达到81.67%，其最适生长条件为pH 为7～10，温度27～37℃.

（3）Monod方程动力学分析结果表明，在三聚氰胺浓度为10～50mg／L时，降解菌MB4具有快速降解能力，米氏方程常数Km＝2.545mg／L，最大降解速率为1.24mg／（L·h）.

（4）经过35d实际土壤培养后，生物炭固定化降解菌MB4对黑土中50～400mg／kg三聚氰胺的降解效率可达52.83%～70.33%.其降解动态符合Logistic方程.

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