火棘原花青素制备及抗氧化功效研究

鄢又玉，沈丹华，王红娟，吴平，赵春芳，余龙江，*

（1.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉430074；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

火棘原花青素制备及抗氧化功效研究

鄢又玉1，2，沈丹华2，王红娟2，吴平2，赵春芳1，余龙江1，*

（1.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉430074；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

以原花青素为评价指标，在单因素实验的基础上，利用中心组合设计和响应面分析优化了火棘果原花青素的提取工艺。结果表明：提取温度，乙醇体积分数和酸醇比对原花青素提取制备影响显著，火棘果原花青素最佳制备工艺为：提取时间80 min，料液比1∶10（W∶V，g/mL），提取温度90℃，乙醇体积分数66%，酸醇比1∶50，提取次数为2次，依照此工艺，原花青素提取率为18.32%，与理论响应值18.55%基本吻合。在此基础上进一步考察了火棘果原花青素与抗氧化能力的相关性，结果表明火棘果原花青素对其抗氧化功效贡献显著。

火棘果；原花青素；响应面优化；抗氧化

火棘（Pyracantha fortuneana（Maxim）Li.）又名赤阳子、红子、火把果、救军粮等，是蔷薇科苹果亚科火棘属常绿野生灌木，广泛分布于我国东南和西南各省的广大地区［1］，我国共有16个省盛产火棘，如贵州省火棘鲜果年产量在2 500万千克以上［2］，湖北省鄂西南及神农架年均产果近1亿千克［3］，资源极为丰富。

火棘果为药食同源植物，含丰富的营养物质和生物活性物质［3-4］。近年来对火棘果中维生素、多糖、黄酮类及微量元素等研究较多［5-6］，而对其中原花青素提取及相关报道相对较少。原花青素（Proanthoyanidins）是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成的黄烷3-醇衍生物的总称，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂［7］，具有非常强的体内抗氧化活性［7］。可广泛应用于改善血液循环、降血压、降血脂、抗脂质过氧化、抗辐射、抗肿瘤、预防白内障、滋润及美白皮肤等［8-10］，火棘果原花青素的开发极具市场前景。

响应面法是采用多元二次回归法作为函数估计的工具，结合数学和统计学建立曲面模型［11］，通过对回归方程的分析找出最优工艺，在工程应用中可缩减工作量并提高准确性［12-13］。目前已广泛用于农业、生物、食品、化学等领域。现通过单因素实验结合Box-Benhnken（BBD）设计对火棘果原花青素提取制备进行优化，得出火棘果原花青素最佳制备工艺，并在此基础上进一步考察其与抗氧化功效的相关性，以此为火棘果未来的精深开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：火棘果于2012年11月中旬采摘湖北恩施来凤地区，干燥粉碎后过20目筛备用。

试剂：实验用水均为去离子水，香草醛、甲醇、无水乙醇、浓盐酸均为分析纯，儿茶素标准品购自上海金穗生物科技有限公司，总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器

UV-5100型紫外可见光分光光度计：上海元析仪器有限公司；DF-101B集热式磁力加热搅拌器：金坛市医疗仪器厂；Centrifuge 5424R型台式高速冷冻离心机：德国Elmendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 儿茶素标准曲线制作

以无水乙醇配制儿茶素母液1 mg/mL。分别稀释成浓度梯度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的溶液，依照“0.5 mL样品+3 mL 4%香草醛甲醇溶液+1.5 mL浓盐酸”反应体系，摇匀，30℃下反应20 min，于500 nm处测定吸光度［14］，以浓度（C）与吸光度（A）进行线性回归，得到标准曲线方程：A=2.087 2C+0.045 1（R2= 0.999 8），表明在儿茶素浓度0.05 mg/mL～0.4 mg/mL范围内，吸光度与浓度线性关系良好。

1.3.2 火棘果原花青素最佳提取条件的确定

分别考察乙醇浓度，料液比，加酸量，提取时间、温度及提取次数等因素对原花青素提取的影响，并从中拟选影响显著的3个因素：乙醇浓度、提取温度、盐酸体积，应用Design-Expert Software8.0.6软件，进行BBD设计，以期确定火棘果原花青素的最优提取工艺。

1.3.3 火棘果原花青素含量计算

将测定出的吸光度值按标准曲线方程：A=

式中：C为提取液浓度，（mg/mL）；n为提取液测试前总稀释倍数；V为提取液总体积，mL；m为秤取的火棘果皮渣质量，g。

1.3.4 提取物总抗氧化能力测定

测定方法：取一定量提取液高速冷冻离心，用pH 6.86的缓冲溶液稀释一定倍数，参照总抗氧化能力（T—AOC）试剂盒操作说明书操作，并记录相关数据。

单位定义：在37℃时，每分钟每克火棘果皮肉粉提取后的提取液使反应体系的吸光度（OD）每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位，单位为unit/g。 2.087 2 C+0.045 1（R2=0.999 8）换算成浓度值，按下面公式计算出提取物中原花青素含量

式中：ODu为测定管吸光度；ODc为对照管吸光度；k为反应体系稀释倍数（=反应液总体积/取样量）；n样品测试前稀释倍数；V为提取液的总体积，mL；m为提取的火棘果皮渣粉质量，g。

2 结果分析

2.1 6种单因素对火棘果原花青素提取率的影响

称取火棘果皮渣粉20 g，以乙醇为提取溶剂，一定料液比及提取温度，回流提取一定时间后，趁热过滤，冷却后乙醇定容至一定体积，适当稀释后按1.3.1中操作，测吸光度值。分别依次考察了提取时间，提取温度，乙醇浓度，料液比，盐酸加入量及提取次数对原花青素提取得率的影响，结果分别见图1～图6。

图1 提取时间对火棘果原花青素提取率的影响Fig.1 Effect of time on yield of proanthocyanidins

图2 提取温度对火棘果原花青素提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on yield of proanthocyanidins

图3 乙醇浓度对火棘果原花青素提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield of proanthocyanidins

图4 料液比对火棘果原花青素提取率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on yield of proanthocyanidins

图5 浓盐酸的量对火棘果原花青素提取率的影响Fig.5 Effect of hydrochloric acid volume on yield of proanthocyanidins

图6 提取次数对火棘果原花青素提取率的影响Fig.6 Effect of extraction frequency on yield of proanthocyanidins

由图1可知：随着提取时间的延长，提取液中原花青素溶出量最初快速增加，至80 min后增幅减小，并且，随加热提取时间延长，有可能导致溶出的原花青素降解而影响其活性，综合考虑能耗及提取效率，提取时间选为80 min较适。

由图2可知：随着提取温度的逐步升高，提取液中原花青素的浓度逐步增加。当温度上升至90℃左右时，随着温度进一步上升，原花青素浓度增加不明显，甚至略有下降趋势。由此说明随着温度升高，溶剂分子运动速度加快，从而使其渗透、扩散、溶解速度加快；另一方面，高温也使细胞膜流动性增强，有利于原花青素从细胞内转移到提取溶剂中。但是，温度过高也同时加快了溶出原花青素的氧化分解，从而使原花青素浓度下降。综合考虑能耗及经济成本等因素，提取温度选为90℃时较合适。

由图3可知：随着乙醇浓度的增加，提取液中原花青素的浓度先逐渐增大，然后逐步减小，当乙醇浓度达到50%左右时，原花青素提取率相对最高，这表明此时原花青素溶出量达到最大，此后随着乙醇浓度进一步增加，醇溶性杂质及疏水性强的成分溶出量相对增加，原花青素溶出量相对减少，因此，提取所用乙醇的最适浓度选为50%。

由图4可知：随着料液比的增加，原花青素溶出量（以同一容积中原花青素浓度表示）先快速增加，随后增幅减缓。这表明，提取溶剂量大时，火棘果皮渣细胞膜在短时间内急剧膨胀破裂，原花青素被迅速萃取进入溶剂；而料液比较小时，一方面无法使原料达到有效浸泡，另一方面溶剂中的原花青素也极易达到饱和，从而抑制其进一步溶出。当料液比为1∶10时，原花青素几乎被最大限度提取出来了。综合考虑成本及后续浓缩处理，料液比选取1∶10左右较为合适。

由图5可知：酸性条件更有利于原花青素的提取，其主要是因为酸可抑制酚类物质与金属离子的沉淀反应，增强了溶剂破坏结合键的能力，破坏酚类物质与蛋白质、多糖、及自身之间的氢键和疏水键作用，从而提高原花青素的溶出量。但酸量达到3 mL后酸的增加量对原花青素的提取率影响减小甚至使原花青素酸解。因此考虑到后期工业化生产，酸度过高将导致设备易腐蚀等，选取加酸量为3 mL左右较合适。

由图6可知，随着提取次数的增加，原花青素提出量逐渐减少，综合考虑工作量、生产成本、工作效率及后续处理等因素，选取提取2次较为合理，能较大程度提取出原花青素。

2.2 响应面法优化火棘果原花青素提取工艺

2.2.1 响应面分析因素水平的选取

根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，在单因素试验基础上选取对火棘果原花青素影响显著的3个因素：提取温度，乙醇浓度，盐酸加入量进行进一步优化考察。实验因素与水平设计见表1。

表1 响应面实验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis experiment

2.2.2 响应面优化设计方案

以乙醇浓度A、提取温度B、盐酸体积C为自变量，以火棘果原花青素提取率为响应值（Y），进行响应面优化实验，实验方案及结果见表2。

表2 响应面实验优化方案及结果Table 2 The optimization scheme and results of response surface experimental design

2.2.3 多元二次响应面回归模型的建立与分析

对表2实验结果通过RSA软件程序进行二次回归响应面分析，建立多元二次响应面回归模型：

Y=17.53+1.52A+0.18B+4.48C+0.73AB+1.19AC-0.77BC-2.22A2-1.58B2-5.91C2，各因素的方差分析见表3。

表3 二次响应面回归模型方差分析Table 3 Mean square analysis of response surface regression model

表3中，失拟项0.526 7＞0.05不显著，模型项（Prob＞F）＜0.000 1高度显著，模型的相关系数R2（模型平方和/总差=381.39/386.20=98.75%）较大，表明该模型拟合度好。

从表3还可以看出，影响火棘果原花青素提取率的3个因素按影响大小排序依次是C（盐酸体积）＞A（乙醇浓度）＞B（提取温度），其中盐酸体积影响极显著，乙醇浓度为影响显著因素。进一步考察三个因素中交互作用对提取率的影响，对其曲面图和等高线图进行分析，结果见图7，图8及图9。

图7 乙醇浓度和提取温度对火棘果原花青素提取率的影响Fig.7 Effect of ethanol concentration and extraction temperature on yield of proanthocyanidins

曲面图直观地反映了各因素对响应值的影响，图7，图8和图9表明乙醇体积分数，提取温度和盐酸积与提取液原花青素含量均呈二次方程关系。等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则交互作用不显著。图7，图8，图9等高线图表明，乙醇体积分数，提取温度，和酸醇比三者之间均有交互作用，交互作用的影响可能导致响应面预测最佳值与单因素最佳值相对偏移。

2.3 模型的验证性实验

图8 乙醇浓度和盐酸体积对火棘果原花青素提取率的影响Fig.8 Effect of ethanol concentration and hydrochloric acid volume on yield of proanthocyanidins

图9 提取时间和盐酸体积对火棘果原花青素提取率的影响Fig.9 Effect of extraction temperature and hydrochloric acid volume on yield of proanthocyanidins

通过二次回归方程，软件分析预测得到的各影响因素最佳值为：乙醇浓度65.68%，提取温度91.98℃，加酸量4.01 mL，料液比1∶10（W/V∶g/mL），提取时间80 min，提取2次。此时火棘果原花青素理论预估提取率为18.55%。调整该工艺为：乙醇浓度66%，提取温度90℃，加酸量4 mL，料液比1∶10（W/V∶g/mL），提取时间80 min。同时提取3组，实际测得的平均提取率为18.32%，与理论预测值18.55%基本吻合，因此，采用RSA法优化得到的提取条件准确可靠，具有实用价值。

说明：为更加清楚的反映火棘果原花青素提取工艺参数，现将加酸量与提取液体积综合考虑，得最优工艺下的酸醇比为1∶50（4 mL/200 mL）。

2.4 火棘果原花青素抗氧化与其最优工艺下的总抗氧化能力的对比

参照本实验室得到的火棘果抗氧化成分优化工艺，用68%的乙醇，按料液比1∶10（W/V∶g/mL），酸醇比1∶25，在90℃下提取60 min，提取2次，合并提取液，定容至200 mL，测定提取液的总抗氧化能力；根据本实验得到的火棘果原花青素优化工艺，用66%的乙醇，按料液比1∶10（m/v），酸醇比1∶50，在90℃下提取80 min，提取2次，合并提取液，定容至200 mL，测定原花青素的抗氧化能力。每组实验各重复提取3次，结果见表4。

表4 火棘果抗氧化成分的抗氧化能力与原花青素抗氧化能力比较Table 4 Comparison of antioxidant capacity between proanthocyanidins with antioxidant ingredients

从表4数据分析得出：火棘果中原花青素所贡献的抗氧化能力在火棘果抗氧化提取物总抗氧化能力中占了很大比例，火棘果原花青素的提取具有很高的应用价值。

3 结论

以火棘果原花青素提取率为量化指标，在单因素实验的基础上，利用中心组合设计和响应面分析优化了火棘果原花青素的提取制备工艺。确定了火棘果原花青素最佳提取工艺为乙醇浓度66%，提取温度90℃，酸醇比1∶50（V/V），料液比1∶10（W/V∶g/mL），提取时间80 min，提取2次。在此条件下，原花青素提取率为18.32%，与理论响应值18.55%基本吻合。进一步考察火棘果原花青素与其抗氧化能力的相关性，结果表明火棘果原花青素对火棘果抗氧化能力贡献显著。

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Pyracantha Fortuneana Procyanidins Preparation and Their Correlation Research with Antioxidant Activity

YAN You-yu1，2，SHEN Dan-hua2，WANG Hong-juan2，WU Ping2，ZHAO Chun-fang1，YU Long-jiang1，*
（1.School of Life Science&Technology，Huazhong University of Science&Technology，Wuhan 430074，Hubei，China 2.School of Biological&Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

Take proanthocyanidins as the evaluation target，on the basis of single factor experiments，the central composite design and response surface analysis are adopted to optimize the extraction technology of proanthocyandins from pyracantha fortuneana fruits.The results show that the extraction temperature，ethanol concentration （V/V）and the ratio of acid to alcohol are factors that affect proanthocyanidins significantly.The optimizing extraction process is：extraction time of 80 min，material-solvent ratio of 1∶10 （W∶V，g/mL），temperature of 90℃，ethanol concentration of 66%，acid-ethanol ratio of 1∶50 and extraction times of 2. Under these conditions the extraction rate of proanthocyanidins is 18.32%and fits well with the predicted value 18.55%.Further，correlations of the proanthocyanidin with the total antioxidant capacity of pyracantha fortuneana are compared，and the results show that pyracantha fortuneana Proanthocyanidins have strong antioxidant activity.

pyracantha fortuneana；proanthocyanidins；optimization of response surface analysis；antioxidant activity.

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.010

2013-12-01

鄢又玉（1975—），女（汉），博士，研究方向：天然药物。

*通信作者