改良的差异裂解法提取混合斑中精子DNA

.泉州市公安局刑侦支队 .晋江市公安局刑事科学技术室 程 冲 王 芳

在强奸类案件中，含有精子的混合斑（阴道拭子、内裤等等）是一种常见的检材，一般采用差异裂解法[1]提取精子DNA。在实际检案中，混合斑第一步消化时间、精子沉淀物洗涤时间以及纯化的时间都较长，特别是遇到大量混合斑检材时，耗费时间更长，本文采用了改良的差异裂解法可以减少提取时间，并能保证提取结果。

1 材料与方法

1.1 样本

本实验室日常受理的混合斑检材34份（PSA试纸条检测均为阳性），其中阴道拭子18例，内裤13例，卫生纸3例。

1.2 仪器和试剂

9700型扩增仪（AB公司）；3130XL型测序仪（AB公司）；DNA IQTM系统（Promega公司）；Loopile First-hand PCR Kit试剂盒；Identifiler Plus试剂盒（AB公司）；磁力架。

1.3 方法

1.3.1 常规差异裂解法

内裤裆部布片剪取约 1cm×1cm，卫生纸剪取约1cm×1cm，阴道拭子剪取外层棉花一半，剪碎后放入 1.5ml离心管中，按文献[1]中差异裂解法消化 34例混合斑检材中女性成分，洗涤的沉淀物按照文献[2]中磁珠法提取精子DNA，DNA溶液4℃保存备用。

1.3.2 改良差异裂解法

（1）内裤裆部布片剪取约 1cm×1cm，卫生纸剪取约1cm×1cm，阴道拭子剪取外层棉花一半，剪碎后放入 1.5mL离心管中，加入1mL TNE溶液，100μL 10% SDS溶液，10μL 10mg/mL PK溶液，混匀后56℃恒温保存2小时。（2）套管离心后转移液体至另一1.5mL离心管，13000r/min 离心3分钟后，将离心管置于磁力架上，打开盖子，迅速、平稳翻转磁力架倾倒上清液。（3）倾倒后，沉淀物中加入1mL TNE溶液，振荡后13000r/min 离心3分钟，再将离心管置于磁力架上，打开盖子，迅速、平稳翻转磁力架倾倒上清液，重复步骤（3）两次。（4）TNE洗涤3次后，沉淀物中加入Loopile First-hand PCR Kit试剂盒A-裂解液，95℃ 3分钟，加B液后振荡混匀，13000r/min 离心3分钟，上清液4℃保存备用。

1.3.3 DNA扩增及产物检测

采用Identifiler Plus试剂盒在9700型扩增仪进行PCR扩增，扩增体系为 10μL，DNA 模板为 1μL，扩增参数参照Identifiler Plus试剂盒操作手册。取上述 PCR扩增产物经3130XL型测序仪电泳，结果用GeneMapper ID v3.2软件进行分析，获得等位基因分型图谱。

2 结果

本文中，34例混合斑检材经不同提取方法检验的结果见表1。采用改良的差异裂解法提取混合斑中精子 DNA，34例检材中有 31例获得了单一男性分型，2例检材获得混合STR分型，剩余1例未获得分型，未获得分型的检材经涂片镜检，未能发现精子细胞。比较不同提取方法的检验结果，改良的差异裂解法检出率高于常规差异裂解法，究其原因，56℃恒温有助于提高PK消化效率，能进一步去除女性成分。改良法在提取时间上较常规法将近减少一半，并且对不同混合斑检材均有较好的适应性。同时，改良法与常规法检验结果在峰高、平衡性方面无显著差异。

表1 不同提取方法检验结果（检出单一男性分型）

3 讨论

用传统的差异裂解法处理混合斑检材时，上皮细胞与精子细胞的分离并不都是完全的，特别是在含有大量女性上皮细胞且精子细胞含量少的混合斑检材中，一些上皮细胞在第一步消化时没有消化干净，使得精子 DNA溶液中出现女性成分，表现为混合分型，不利于结果判断。本文中，由于采用了改良的差异裂解法，在第一步消化时采用56℃孵育，能提高蛋白酶K裂解效率，精子在二硫基的保护下不受影响，而女性上皮细胞则能够基本消化干净，因此，改良法在检出单一男性分型的数量要高于传统法，同时，在第一步消化完毕后，改良法在精子沉淀物的洗涤时间上也具有较大优势，由于采用磁力架倾倒的方式一步去除洗涤液，减少了移液器的手工操作，降低劳动强度，在实际工作中具有重要意义。

综上所述，改良的差异裂解法极大程度上减少了提取时间，提高了劳动效率，此改良方法无需特殊设备，适用于常见的混合斑检材，在日常检案中具有较高的应用价值。

[1]郑秀芬.法医DNA分析[M].北京∶中国人民大学出版社,2002.

[2]郑秀芬,凌凤俊,涂政.模板 DNA 磁珠提取法[J].中国法医学杂志, 2003,18（2）∶107.