鸭疫里默氏杆菌pfs基因的克隆表达及单克隆抗体制备

范国博，韩先干，张宇曦，2，王少辉，左佳坤，徐 达，3，于圣青

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2. 安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；3. 扬州大学兽医学院，扬州 225000）

鸭疫里默氏杆菌pfs基因的克隆表达及单克隆抗体制备

范国博1，韩先干1，张宇曦1，2，王少辉1，左佳坤1，徐 达1，3，于圣青1

（1. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2. 安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036；3. 扬州大学兽医学院，扬州 225000）

将鸭疫里默氏杆菌的pfs基因进行原核表达，重组蛋白经纯化后作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，利用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株。通过间接ELISA法测定腹水效价、Western blot法检测其免疫反应性，并鉴定抗体的亚型。重组蛋白SDS-PAGE检测结果验证得到26 kDa Pfs蛋白，免疫小鼠后最终获得1株阳性杂交瘤细胞株，命名为2E2E6，为IgG1亚类，间接ELISA法检测腹水效价为1：64 000。Western blot结果表明制备的单克隆抗体具有良好的免疫反应性。本研究成功制备了Pfs的单克隆抗体，为进一步研究Pfs在鸭疫里默氏杆菌中的作用提供了参考。

鸭疫里默氏杆菌；Pfs蛋白；单克隆抗体

鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎（infectious serositis），是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一种急性或慢性接触性传染病，可感染鸭、鹅和火鸡等禽类，主要侵害1～8周龄的雏鸭，特别是2～3周龄雏鸭最易感［1］。该病自然感染发病率一般为20%～40%，有的鸭群可高达70%。发病鸭死亡率为5%～80%，是造成当前养鸭业经济损失的主要传染病之一。1932年，Hendrison和Hilbert首次分离鉴定RA［2］，1993年Segers等［3］根据培养特性、16S rRNA序列和表型，明确了其分类地位并建议成立鸭疫里默氏杆菌属。RA的血清型复杂，在不同国家和地区引起鸭疫里默氏杆菌病流行的血清型不同，目前国际上公认的血清型有21个［4］。

5'-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（5'-Methylthioadenosine/S- adenosylhomocysteinen ucleosidase，Pfs）对细菌具有重要的调控作用，参与细菌的甲硫氨酸循环，可以产生密度感应信号分子AI-2［5］。本实验室前期研究发现Pfs对RA的生物学特性及AI-2合成能力方面均具有重要作用，然而RA Pfs结合底物的活性位点尚未可知。本研究通过克隆表达纯化RA Pfs蛋白，以此作为免疫原成功制备了稳定且特异的RA Pfs单克隆抗体1株，并命名为2E2E6，为进一步研制RA检测试剂盒及Pfs的活性位点的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒和实验动物 BALB/c小鼠购自中国科学院斯莱克实验动物中心；重组表达载体pET28a-Pfs（RA）、SP2/0骨髓瘤细胞、检测用菌种鸭疫里默氏杆菌（Hxb2、Th4、CH1、CH3）、大肠杆菌（DE17、DE47）、沙门氏菌（CVCC1805）和禽巴氏杆菌（CVCC493）均由本实验室保存。

1.2 试剂和仪器 RPMI1640和胎牛血清购自BIOWEST公司；HAT、HT、SEPPIC ISA206和聚乙二醇均购自Sigma公司；HRP标记羊抗鼠二抗-、异丙醇硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）、DAB增强型底物显色试剂盒、可溶性单组分TMB底物溶液均购自天根生化科技有限公司；蛋白质分子质量标准购自Fermentas公司；小鼠单克隆抗体分型试剂盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP购自Southern Biotech公司；多功能酶标仪购自BioTek公司。

1.3 鸭疫里默氏杆菌Pfs的表达及纯化 将重组表达载体pET28a-Pfs（RA）转化大肠杆菌BL21（DE3），37℃培养至OD600约为0.6～0.8，经IPTG诱导表达后，收集菌体，裂解缓冲液重悬菌体，超声破碎裂解，离心后分别收集上清和沉淀并进行SDS-PAGE分析，以检测重组蛋白Pfs的表达情况。沉淀经0.5% TritonX-100裂解缓冲液溶解，用不同浓度的尿素溶解包涵体，然后通过SDS-PAGE分析以检测重组蛋白Pfs的溶解情况。最后利用His-Binding-Resin亲和层析Ni柱对重组蛋白进行纯化，分别用不同浓度的咪唑缓冲液进行洗脱纯化，纯化后的蛋白利用BCA法测定其浓度。

1.4 鸭疫里默氏杆菌Pfs蛋白单克隆抗体细胞株的制备

1.4.1 动物免疫 取6～8周龄BALB/c雌性小鼠，将纯化的Pfs重组蛋白透析复性后浓缩至1 mg/mL，将适量重组蛋白加入等体积的SEPPIC ISA206佐剂进行乳化，充分乳化后于小鼠背部多点皮下注射，按照100 μg/只的剂量；3次免疫后小鼠尾静脉采血，ELISA检测血清的抗体效价。选择血清抗体效价最高的小鼠，腹腔注射不添加佐剂的重组蛋白100 μg，72 h后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。

1.4.2 间接ELISA检测方法的建立 通过方阵滴定法确定间接ELISA法的抗原和抗体的最适浓度，抗原为纯化的Pfs重组蛋白，抗体选用小鼠免疫表达纯化的Pfs后制备的阳性血清。

用包被液（pH=9.6）将纯化的Pfs蛋白稀释至最适工作浓度，每孔100 μL纯化蛋白稀释液进行包被，37℃作用2 h，然后用PBST（含5 ‰Tween-20）洗涤3次并拍干；每孔加入300 μL含5%脱脂乳的PBS封闭液，室温封闭，PBST洗涤3次并拍干，-40℃保存备用。

1.4.3 单克隆抗体的制备及筛选 将融合后细胞与饲养细胞混合，通过HAT培养基重悬，以100 μL/孔加入96孔细胞培养板，静置培养7～10 d，显微镜观察细胞集落长至培养孔1/4时，吸取细胞上清进行ELISA检测，筛选只能与重组蛋白反应但不与表达载体标签蛋白反应的阳性克隆，同时每孔加入200 μL HT培养基继续培养。经ELISA检测后呈阳性克隆的细胞利用有限稀释法进行亚克隆筛选，直至100%阳性单克隆细胞。

1.5 鸭疫里默氏杆菌Pfs单克抗体的生物学特性分析

1.5.1 杂交瘤细胞株的稳定性测定 将杂交瘤细胞株在相同的操作下连续传30代，进行间接ELISA试验，测定其每代细胞培养上清效价；将杂交瘤细胞株冻存于液氮中，分别在3、6、12个月后取出冻存的杂交瘤细胞株复苏，扩大培养后制备腹水，进行间接ELISA检测单抗的腹水效价。

1.5.2 Ig类及亚类测定 采用小鼠单克隆抗体分型试剂盒SBA ClonotypingTMSysterm/HRP测定已制备的Pfs单克隆抗体Ig亚类，操作方法参照产品说明书进行。

1.5.3 单抗腹水的制备及效价检测 将液体石蜡腹腔注射于10周龄BALB/c雌性小鼠，每只0.3 mL，7～10 d后接种筛选到的阳性杂交瘤细胞，腹腔注射，每只5×105PFU/0.2 mL。随后观察小鼠腹部状态，待腹部出现明显膨大，即可收集腹水，同时采用间接ELISA法测定腹水单抗效价。

1.5.4 腹水单克隆抗体的Western blot鉴定 对纯化的Pfs蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后，利用半干转印（55 mA电转60 min）将Pfs转印至活化后的PVDF膜上，将膜静置于PBS封闭液（含有5 mg/ L脱脂乳）中过夜；PBST洗3次，每次10 min，将腹水1∶10 000稀释，37℃与PVDF膜作用2 h；PBST洗5次，再用1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG室温作用1.5 h，PBST彻底洗涤后，加入DAB底物显色10 min至出现明显条带，终止反应，观察结果。同法检测鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌和沙门菌与该腹水的特异性反应情况。

2 结果

2.1 鸭疫里默氏杆菌Pfs的表达及纯化 SDS-PAGE检测结果显示，在26 kDa处可见特异条带，与预期一致（图1），表明在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达融合蛋白His-Pfs。进一步分析表明，重组蛋白主要以包涵体形式存在。经His-Binding亲和纯化柱纯化后，在150 mmol/L咪唑浓度时获得较为纯净的蛋白（图1），经BCA蛋白浓度测定试剂盒测得浓度可达到0.5 mg/mL。

图1 鸭疫里默氏杆菌Pfs蛋白的原核表达及纯化Fig.1 Expression and purifi cation of Pfs from Riemerella Anatipestifer

2.2 鸭疫里默氏杆菌Pfs蛋白单克隆抗体细胞株的制备

间接ELISA法检测结果表明小鼠的血清抗体效价达到1∶3200。小鼠腹腔注射不含佐剂的Pfs蛋白100 μg以加强免疫，72 h后取小鼠脾细胞，并与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。经3次亚克隆筛选，最终获得1株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌Pfs单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2E2E6。

2.3 单抗腹水的效价检测 制备并收集单克隆抗体腹水，间接ELISA法检测腹水单抗效价，结果表明杂交瘤细胞株2E2E6的腹水效价达到1∶64 000（如图2）。

图2 Pfs单克隆抗体腹水ELISA效价检测Fig.2 The ELISA titer of the monoclonal antibody against Pfs in the ascite

2.4 Ig类及亚类测定 将获得的Pfs单克隆抗体经小鼠单克隆抗体分型试剂盒检测，结果表明细胞株2E2E6为IgG1亚类，轻链为κ链。

2.5 腹水单克隆抗体的Western blot鉴定 对RA 不同血清型的菌株进行Western blot检测（图3），结果表明RA Pfs单克隆抗体2E2E6仅与血清2型Th4株发生特异性反应，与血清1型和10型无交叉反应性。另外，对大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌亦无特异性反应，说明单克隆抗体2E2E6特异性良好。

3 讨论

RA作为危害养鸭业的重要病原之一，血清型较为复杂，且对抗生素具有耐药性，严重制约对该病的防控。由于RA不同血清型之间无交叉保护力或交叉保护率低，所以对RA的血清型检测工作尤为重要［6］。

图3 Western blot鉴定Pfs单克隆抗体2E2E6特异性Fig.3 Western blot analysis of the specifi city of MAb 2E2E6against Pfs

本研究选用His标签较小的表达载体pET28a作为重组蛋白的表达载体，经诱导、表达及纯化后获得了高纯度和高活性的免疫原Pfs蛋白，获得的Pfs单克隆抗体具有较强的稳定性和特异性。调查发现检测RA的分子生物学方法主要有基于该菌16S rRNA和OmpA的PCR方法［7］，基于荚膜多糖基因序列的Real time PCR［8］以及基于groEL基因的LAMP鸭疫方法［9］等，有报道指出可利用RA GroEL单克隆抗体检测RA的方法［10］。

密度感应（quorum sensing，QS）是细菌通过分泌自诱导信号分子（autoinducer，AI）来监测细菌群体密度，并协调细菌生物功能的交流机制，目前已成为微生物学的研究热点。Pfs在细菌内自体诱导分子合成过程中是调节平衡的关键酶，Pfs抑制剂可抑制自体诱导分子的合成，从而干扰密度感应系统，因此Pfs可作为新型抗菌药物的设计方向［11］。Pfs广泛存在于RA中，且具有一定的保守性，本研究获得的Pfs单克隆抗体对血清2型RA具有较强的反应特异性，对血清1型和10型并无交叉反应性，表明所获得的Pfs单克隆抗体具有良好的反应特异性，从而为进一步研制鸭疫里默氏杆菌分型检测试剂盒奠定基础。

研究表明Pfs在合成自体诱导分子和甲硫氨酸代谢中具有重要作用，一方面，SAH在Pfs和LuxS作用下转化为同型半胱氨酸（Hcy），腺嘌呤和信号分子AI-2；另一方面，MTA由多胺生物合成途径产生，Pfs可以催化MTA，不可逆水解为腺嘌呤和5-甲硫基-D-核糖（MTR），腺嘌呤被广泛分布的腺嘌呤转磷酸核糖茎酶回收至腺苷酸库中，而MTR则被磷酸化产生5-甲硫基-D-核糖-1-磷酸盐（MTR-1-P）并转化为甲硫氨酸［12-14］。Pfs与底物反应具有选择特异性［15］，本研究制备的单抗亦为进一步研究Pfs活性位点提供了参考。

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PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES TO PFS OF RIEMERELLA ANATIPESTIFER

FAN Guo-bo1， HAN Xian-gan1， ZHANG Yu-xi1，2， WANG Shao-hui1， ZUO Jia-kun1，XU Da1，3， YU Sheng-qing1
（1. Shanghai Veterinary Research Institute， CAAS， Shanghai 200241， China； 2. College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China； 3. College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225000， China）

To prepare the monoclonal antibody against Pfs protein of Riemerella anatipestifer， the recombinant pfs （rpfs） was expressed and purified for immunization of BALB/c mice. After immunization for 3 times， mice were sacrificed for harvest of spleens. The splenocytes from the immunized mice were fused with murine myeloma SP2/0 cells. Positive clones were identifi ed by screening with indirect ELISA and sub-cloned for 3 times. The hybridoma 2E2E6 producing anti-pfs monoclonal antibody （MAb） was obtained. The isotype of this MAb was determined to be IgG1. Ascitic fl uid was titrated to be 1：64 000 in ELISA. In Western blot， MAb 2E2E6 reacted with serotype 2 R.anatipestifer， but not with R.anatipestifer serotypes 1 and 10. The availability of MAb 2E2E6 would be useful for further study of pfs activity.

Riemerella anatipestifer； Pfs； monoclonal antibody

S852.612

A

1674-6422（2015）05-0041-05

2015-06-04

国家自然科学基金（31370045、31572546、31272591）

范国博，女，硕士研究生，预防兽医学专业

于圣青，E-mail：yus@shvri.ac.cn； 韩先干，E-mail：hanxgan@163.com