草甘膦对油茶林土壤微生物数量及酶活性的影响

陈隆升， 陈永忠， 彭映赫， 李志刚， 彭邵锋，唐 炜

(1.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004； 2.国家油茶工程技术研究中心， 湖南 长沙 410004)

草甘膦对油茶林土壤微生物数量及酶活性的影响

陈隆升1，2， 陈永忠1，2， 彭映赫1，2， 李志刚1，2， 彭邵锋1，2，唐 炜1，2

(1.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004； 2.国家油茶工程技术研究中心， 湖南 长沙 410004)

以草甘膦为除草剂，研究其对油茶林土壤微生物及酶活性的影响。结果表明：草甘膦处理60天后，土壤真菌、细菌和放线菌的生长均受到极显著的抑制，分别比对照减少了44.7%、58.2%和54.7%；草甘膦处理150天后，土壤真菌、放线菌的数量仍极显著少于对照，但细菌数量显著高于对照。土壤脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性在草甘膦处理60天后均显著低于对照；草甘膦处理150天后，土壤脲酶的活性则由抑制转变为激活，高于对照7%；土壤磷酸酶活性的抑制作用有所缓解，土壤过氧化氢酶活性的抑制作用则有所增加。草甘膦处理60天、150天后，土壤、油茶果实、叶片中均未检测出有草甘膦残留。

油茶； 除草剂； 草甘膦； 土壤微生物； 土壤酶活性

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)是我国特有的重要木本油料树种[1]，是我国经济大力发展的朝阳产业。目前全国现有油茶林面积400多万hm2，主要分布在湖南、江西、广西等南方14个省区。近几年来，全国新造油茶良种林100多万hm2，其中湖南省新造油茶良种林200多万hm2。但是，由于劳动力资源的短缺和劳动力成本的大幅度上升，油茶林的抚育方式发生了巨大的变化，广大企业、林农开始使用除草剂代替传统的人工除草抚育，使得油茶林抚育成本大幅度降低。草甘膦(Glyphosate)为一种高效、低毒、广谱的非选择性除草剂，在油茶林抚育中得到了广泛的应用。众多学者的研究结果表明，草甘膦显著影响着土壤微生物环境[2-5]和土壤酶活性[6-7]。目前，国内暂未开展草甘膦对油茶林的影响研究，除草剂对油茶林生态环境以及果实品质的作用机制及影响程度尚无定论。作者研究了草甘膦对油茶林土壤环境的影响，并测定了其在土壤以及油茶植株体内的残留量，以期为油茶林绿色生产提供技术支撑。

1 试验区概况

试验地位于湖南省长沙市南郊雨花区湖南省林业科学院试验林场，其地理坐标为113°01′30″E、28°06′40″N，属低丘岗地地貌，最高海拔108 m，最低海拔50 m，坡度多在25°以下。该区年平均气温17.5 ℃，1月平均气温4.6 ℃，7月平均气温28.6 ℃，极端最高气温42.7 ℃，极端最低气温-10.4 ℃，年平均降水量1 378 mm，年平均相对湿度81%，年日照时数1 814.8 h，全年无霜期275天；气候属亚热带季风湿润气候，气候温和、四季分明。试验地土壤系第四纪红色粘土网纹层母质发育的酸性红壤，土层较深厚，大多在1 m左右，但多石砾，pH值4.5～5.5。油茶林下杂草主要有的芒萁、蕨、硬骨草、野香茅、扛板归等。

2 研究方法

2.1 试验设计

选择3～4年生油茶幼林为试验林，分别设置对照(人工除草)和喷施草甘膦除草剂2种处理，采用随机区组试验设计，每个处理样地0.1 hm2，样地中间设置10 m隔离带，3次重复。

(1)人工除草。于2014年5月16日和7月2日进行人工除草，将油茶树兜1 m范围内杂草人工除净，并覆盖于树兜周围。

(2)喷施草甘膦除草剂。2014年5月16日喷施除草剂(除草剂为金浓达41%草甘膦异丙胺盐水剂；上海沪联生物药业(夏邑)有限公司生产)，用量2.0 kg/hm2，按1.25%的浓度兑水均匀喷洒在杂草上。

2.2 样品采集与预处理

于2014年7月15日(60天)、10月13日(150天)采集土壤样品，取离地面5～15 cm的表土，按混合采样法取10个点的混合样，去除根系和石砾，过2 mm筛。将采集的土样分成2份：1份4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物数量及微生物种类的测定；另1份室内风干，用于土壤酶活性和草甘膦含量的测定。

采取土壤样品的同时，采集油茶果实、叶片样品，每个样地随机选择20株树，每株树采20片叶、5个果；分别将果样、叶样混合于室内风干，用于测定草甘膦残留量。

2.3 测定方法

2.3.1 土壤微生物数量测定 土壤微生物各类群数量的测定采用稀释平板法。所用培养基：细菌为牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌为改良高氏1号培养基；真菌为马丁氏孟加拉红培养基。每1类群设3个重复，3个稀释度。于各类培养基分别接种后，细菌30 ℃培养2天、真菌和放线菌28 ℃培养4天和7天后进行计数。

2.3.2 土壤酶活性测定 过氧化氢酶、脲酶和磷酸酶分别采用紫外分光光度法[8]、靛酚蓝比色法[9]和对硝基苯磷酸二钠比色法[10]测定。

2.3.3 草甘膦残留量测定 草甘磷残留量测定在中国广州分析测试中心测定，采用LC-MS/MS测定方法。

(1)样品处理。

样品提取：取粉碎均匀样本2 g(精确到0.01 g)置于50 mL聚丙烯(PP)塑料离心管中，加入20 mL超纯水，涡旋混匀，超声10 min，4 000 r/min离心10 min，取出收集上清液，待净化。

SPE净化：取Thermo PEP(60 mg/3mL)SPE小柱，依次加入3 mL甲醇、3 mL超纯水、1 mL待净化样液，重力自流；再加入1 mL待净化样液，收集流出液，待衍生化。

衍生化：准确移取1.00 mL待衍生液至2.00 mL进样瓶中，加入0.20 mL硼酸缓冲液(0.2 mol/L)及0.20 mL FMOC-Cl溶液(10 g/L)，涡旋混匀1 min；室温放置2 h，在4 000 r/min离心10 min后取出；取上清液过0.22 μm滤膜，待进行LC-MS/MS测定。

(2)LC-MS/MS测定

仪器型号：Agilent 1200LC/6410B MS液相色谱/串联四级杆质谱联用仪。

色谱条件：色谱柱为Hypercarb柱(100 mm×2.1 mm，3.0 μm)；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量5 μL；流动相A0.1%氨水(含有10 mM乙酸铵)，流动相B乙腈；分析时间6.5 min。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；负离子扫描模式；多反应监测(MRM)采集方式；干燥气温度(GasTemp)350 ℃；干燥气流量(Gas Flow)10.0 L/min；雾化气压力(Nebulizer)275.8 kPa(40.0 psi)；毛细管电压(Capillary)5 500 V；质量分析器分辨率均为Unit。

在上述条件下，取含有内标的对照品溶液和样品溶液各5.0 μL注入液相色谱-串联四极杆质谱仪进行测定，以对照溶液目标峰的保留时间和MRM质谱监测离子对为依据进行定性，以对应的MRM离子对的峰面积按外标法计算样品中目标物的含量。

2.4 数据分析

采用EXCELL进行数据分析。

3 结果与分析

3.1 草甘膦对油茶林土壤微生物数量的影响

由表1可知：与对照相比，油茶林地使用草甘膦除草剂60天后，土壤真菌、细菌和放线菌的数量均极显著(p<0.01)减少，分别减少了44.7%、58.2%和54.7%。使用草甘膦除草剂150天后，土壤细菌的数量显著(p<0.01)增加，增加了23.4%；土壤真菌和放线菌的数量均极显著(p<0.01)减少，分别减少了69.8%和17.8%。上述结果表明，草甘膦对土壤微生物的生长存在长时间显著的抑制作用，且不同种类的土壤微生物对草甘膦的敏感程度存在巨大差异。

表1 草甘膦对油茶林土壤微生物数量的影响Tab.1 EffectofglyphosateonnumberofsoilmicrobialofCamelliaforest(个/g)序号处理土壤真菌土壤细菌土壤放线菌60天150天60天150天60天150天1草甘膦4.71×1030.74×1031.28×10101.16×1057.34×1031.94×1042对照(CK)8.51×1032.45×1033.06×10100.94×1051.62×1042.36×104F值39.0**153.6**117.8**15.4*443.2**34.3**

3.2 草甘膦对油茶林土壤酶活性的影响

从表2中可以看出：与对照相比，油茶林地在喷施草甘膦除草剂60天后土壤脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性均显著(p<0.05)降低，分别降低了16.2%、21.9%和29.3%。喷施草甘膦除草剂150天后土壤脲酶的活性极显著(p<0.01)升高，比对照升高了7%；磷酸酶和过氧化氢酶的活性则均极显著(p<0.01)降低，分别降低了11.2%和39.2%。上述结果表明，草甘膦对土壤过氧化氢酶活性的抑制作用最大，其次是磷酸酶；对土壤脲酶活性的抑制作用较小，而且随着时间的延长反而有激活作用。

表2 草甘膦对油茶林土壤酶活性的影响Tab.1 EffectofglyphosateonsoilenzymeactivityofCamelliaforest序号处理脲酶活性(mg/(g·24h))磷酸酶活性(mg/(g·24h))过氧化氢酶活性(mL/(g·h))60d150d60d150d60d150d1草甘膦11.5918.3042.9337.810.290.172对照(CK)13.8317.1054.9942.570.400.28F值52.9**96**8844**130.5**8.47*1323**

3.3 草甘膦的残留量

人工除草、喷施草甘膦除草剂处理60天、150天后，2个样地的土壤、油茶果实、叶片中均未检测出有草甘膦残留。

4 结论与讨论

众多研究[11-12]表明，草甘膦对土壤微生物有明显的抑制作用。本研究发现油茶林地使用草甘膦除草剂60天后土壤真菌、细菌和放线菌数量均受到明显抑制，150天后土壤真菌和放线菌的数量仍然均极显著少于对照，但土壤细菌数量则比对照显著提高，表明草甘膦可对土壤真菌和放线菌产生长时间的持续抑制作用，而对细菌抑制时间相对较短，随着时间的延长，反而促进了细菌的生长，但从抑制到促进的时间拐点有待进一步的研究。

通过测定土壤脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性变化可有效评价土壤肥力水平、土壤污染状况以及土壤对环境变化的响应。本研究结果表明：油茶林地喷施草甘膦60天后，土壤脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶的活性仍然受到较强的抑制作用，分别比对照降低了16.2%、21.9%和29.3%。喷施草甘膦150天后土壤脲酶的活性则由抑制转变为激活，高于对照7%；土壤磷酸酶活性的抑制作用有所缓解，土壤过氧化氢酶活性的抑制作用则有所增加。许多研究表明，不同类型土壤、不同种类土壤酶的活性对草甘膦的敏感程度不同[13-15]，同时土壤酶活性也受温度、水分、光照等各类外界因素的影响。本研究中草甘膦对土壤脲酶的活性总体上表现为先抑制后激活，对土壤磷酸酶和过氧化氢酶的活性则产生长时间的抑制作用；尤其对过氧化氢酶，在处理150天后，活性仍低于对照39.2%。

本研究中处理60天和150天后，在人工除草和草甘膦处理样地的土壤、油茶果实、叶片中均未检测出有草甘膦残留，表明草甘膦在土壤中的有效成分已降解。许多研究也发草甘膦在土壤[16]、水中[17-18]6天就已基本降解完。草甘膦在油茶林土壤中的降解方式及残留时间有待进一步研究。另外，草甘膦是否进入油茶树体以及在油茶树体的降解转化方式以及是否转化成其它有害物质也有待进一步研究。

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(文字编校：唐效蓉)

EffectofglyphosateonnumberofsoilmicrobialandenzymeactivityofCamelliaforest

CHEN Longsheng1，2， CHEN Yongzhong1，2， LI Zhigang1，2， PENG Yinghe1，2， PENG Shaofeng1，2， TANG Wei1，2

(1.Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， China；2.National Engineering Research Center for Oil-tea Camellia， Changsha 410004， China)

Effect of glyphosateon soil microbial and enzyme activity of Camellia forest was studied in this article.The result showed that after glyphosate treatment 60 d，the number of soil fungi，bacteria and actinomycetes were subject to very significant growth inhibition，it decreased 44.7%，58.2% and 54.7% respectively，which compared with the control.After glyphosate treatment 150 d，the number of soil fungi and actinomycetes is still highly significant than the control，but the number of bacteria was significantly higher than the control.After glyphosate treatment 60 d ，soil urease，phosphatase and catalase activity were significantly than the control.After glyphosate treatment 150 d，soil ureaseactivity from inhibition to activation，7% higher than the control.The soil phosphatase activity inhibition eased，soil catalase activity inhibition is increased.After glyphosate treatment 60 d and 150 d，there were nono detectable residues of glyphosate in soil，camellia fruits and leaves.

CamelliaoleiferaAbel； herbicide； glyphosate； soil microbial； soil enzyme activity

2015-04-22

湖南省林业科技计划“林地除草剂对油茶林影响的研究”(XLK201413)。

陈隆升(1983-)，男，福建省泉州市人，助理研究员，主要从事油茶栽培技术研究。

S 154.3

A

1003 — 5710(2015)04 — 0032 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2015. 04. 008